奶牛产后肝功指数与卵巢静止的关系及其预警作用

王郅杰,白云龙,肖鑫焕,田琳琳,李兴华,孙 震,邹云福,夏 成*,付世新,徐 闯 （.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院,黑龙江 大庆 69；.大庆市农业农村局,黑龙江 大庆 6；.绥化市裕达牧业有限公司,黑龙江 绥化 50；.安达澳森牧业有限公司,黑龙江 安达 59）

过去几十年,由于奶牛养殖业的遗传基因选择,高产奶牛年均单产奶能够达到12 t以上,但是繁殖效率却逐步下降[1]。在奶牛产后乏情中卵巢静止的发病率为26.3%,有的高达40%以上[2]。近年来,卵巢静止新的定义为卵巢上有卵泡波存在,但是在卵泡发生偏势前停止生长,在奶牛产后45～60 d连续检查,无发情表现,卵巢上无黄体和囊肿[3]。许多因素可以引起或加剧奶牛发生卵巢静止,包括过低的营养摄入量,较低的体况评分,过高的产奶量,对应激和疾病的管理不当等[4]。奶牛产后泌乳对营养、能量的需求增高,但是采食量下降,干物质摄入量减少,不能满足奶牛泌乳对能量的需求,体内会出现营养物质如糖类、蛋白质等的代谢紊乱。因此,奶牛围产期营养代谢紊乱被视为引起奶牛产后卵巢静止的第一要素。

奶牛泌乳早期为维持机体代谢以及乳腺泌乳对营养需求大大增加,但日粮能量摄入不足。因此机体将大量动员脂肪组织并释放游离脂肪酸。当游离脂肪酸积累超过肝脏利用能力时,将转化为大量的酮体,引发酮病,或合成三酰甘油贮存于肝实质细胞。这些脂类沉积速度超过肝脏的氧化和分泌速度时,会损害肝脏功能并促发脂肪肝[5-6]。应用肝功指标检测奶牛肝功损伤,不仅可以评估肝功好坏,而且对于预防监测奶牛其他疾病和提高生产、繁殖性能具有重要的意义。尽管有关奶牛肝功与代谢、疾病、健康和生产性能的关系已有许多报道,如张锋等[7]和钱伟东等[8]发现肝功指标丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）都与卵巢静止密切相关。但这些报道主要集中在单一时间点的单个指标上,而多时间点联合指标评估奶牛肝功状况及其对健康、繁殖的影响研究较少。BERTONI等[9]在2013年提出将肝功能指数（liver function index,LFI）作为综合评价母牛健康的指标。它是用奶牛产后3,28 d血中白蛋白（albumin,ALB）、总胆固醇（total cholesterol,TC）和总胆红素（total bilirubin,TBIL）的含量来计算LFI。通常,LFI的取值范围是—12～5。LFI分数越高,奶牛在围产期肝功整体状况较好,营养、代谢及管理越好,奶牛越健康[10-11]。LFI作为一个综合指数,为评估围产期肝脏疾病以及预警卵巢疾病提供了一种廉价、简便的方法[12]。因此,本研究对不同LFI奶牛血浆中能量代谢、氧化应激、矿物质、生殖激素指标以及卵巢静止情况进行检测与判定,界定了LFI对卵巢静止的预警值及风险评估,旨在为奶牛健康监测和卵巢静止防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物本试验在黑龙江省某散栏式自由采食全混日粮（TMR）的集约化牛场进行。奶牛进行科学饲喂,并按照中国泌乳奶牛饲养标准执行。随机选择胎次（3胎左右）、年龄、体况相近的上年度年产奶9 t以上的奶牛100头,选择其中无其他疾病或临床异常的试验奶牛60头。TMR日粮组成:水5.47 kg；高产浓缩4.09 kg；玉米3 kg；压片玉米2 kg；青贮25.37 kg；苜蓿2.5 kg；糖蜜1 kg；大豆皮1.5 kg；豆粕1.3 kg；利乳宝1.2 kg；棉籽1.03 kg；燕麦草0.5 kg。营养水平:粗蛋白17.70%；淀粉22.70%；干物质48%；中性洗涤纤维31.50%；干物质采食量23.50%；酸性洗涤纤维19%；粗饲料来源中性洗涤纤维18.70%；产奶净能3.264 MJ/kg。

1.2动物分组与判定标准在产后50,55 d对60头试验奶牛的双侧卵巢进行B超检测,根据超声影像记录双侧卵巢上最大卵泡的直径。根据5 d内最大卵泡直径的变化计算出卵泡的生长速度（mm/d）。确立2个组奶牛的发情和卵泡发育状况,分为正常发情（estrus,E）奶牛（产后50～60 d内直肠检查有优势卵泡生长,B超检测卵泡直径为15～20 mm,可见发情表现）和卵巢静止奶牛（产后50～60 d直肠检查卵巢没有优势卵泡生长,子宫无异常,B超检查结果卵泡直径小于8 mm,7 d后复检卵泡大小仍无变化并且未见发情表现）[13]。

为了明确奶牛产后肝功状况与卵巢静止的关系,本试验采用了回顾性队列研究,根据LFI大小将所有试验牛分为高（HI-LFI）和低（LO-LFI）2组,每组30头。每头试验牛LFI计算分两步[9],具体如下:（1）白蛋白亚指数（subindex of albumin,SI.ALB）＝50%×C3ALB＋50%×（C28ALB—C3ALB）,总胆固醇亚指数（subindex of TC,SI.TC）＝50%×C3TC＋50%×（C28TC—C3TC）,总胆红素亚指数（subindex of TBIL,SI.TBIL）＝67%×C3TBIL＋33%×（C3TBIL—C28TBIL）；（2）LFI＝（SI.ALB—17.71）/1.08＋（SI.TC—2.57）/0.43—（SI.TBIL—6.08）/2.17。其中,C3和C28分别表示奶牛产后3 d和28 d相应指标在血浆中的浓度。ALB、TC和TBIL在血浆中的浓度单位分别为g/L、mmol/L和μmol/L。LFI的取值范围为—12＜LFI＜5,高水平的LFI表明奶牛围产期肝功和代谢的状况良好,对后续繁殖有利。

1.3样品采集及数据收集

1.3.1血液样品 所有试验奶牛在产后3,28 d（检测ALB,TC和TBIL用于计算LFI）、21 d采集血液样本。清晨空腹尾静脉采血10 m L,加入肝素抗凝,4 000 r/min离心5 min,吸取上清液,再用12 000 r/min离心5 min,分装血浆,—80℃保存。

1.3.2数据收集 利用牛场现有的阿菲金牧场管理系统（Afimilk®3.076,以色列）收集试验奶牛的背景信息,包括年龄、胎次、体况和前胎年泌乳量,产后60 d内的日泌乳量,首次发情天数,产后60 d内的发情次数,输精次数,初配天数,配妊天数,产犊间隔,发情率,受胎率。

1.4血浆生化指标检测

1.4.1血浆能量代谢指标 β-羟丁酸（BHBA,试纸条检测,mmol/L）、游离脂肪酸（NEFA,酶法mmol/L）、葡萄糖（mmol/L,Glu,葡萄糖氧化酶法）、总胆固醇（mmol/L,TC,氧化酶法）。

1.4.2血浆肝功指标 白蛋白（g/L,ALB,溴甲酚绿法）、总胆红素（μmol/L,TBIL,钒酸盐氧化法）。

1.4.3血浆矿物质指标 钙（mmol/L,Ca,偶氮胂Ⅲ法）,磷（mmol/L,P,磷钼酸法）、镁（mmol/L,Mg,二甲苯胺蓝法）。

1.4.4血浆激素指标 生长激素（μg/L,GH）、雌二醇（ng/L,E2）、孕酮（μg/L,P4）、胰岛素样生长因子（μg/L,IGF-1）。以上指标均采用酶联免疫吸附测定法。

1.4.5氧化应激指标 超氧化物歧化酶（U/m L,SOD,比色法）,谷胱甘肽（mmol/L,GSH,酶联免疫吸附测定法）,抑制羟自由基能力（U/m L,酶联免疫吸附测定法）。

1.5数据分析使用IBM SPSS 22.0软件进行试验数据的统计分析。使用独立样本t检验对2组试验奶牛各指标上的差异显著性进行分析。数据以平均数±标准误（x±s x） 的形式表示。采用队列研究的M-Hχ2检验分析LFI和卵巢静止之间的关联性。使用双变量相关性分析和二元Logistic回归模型对疾病进行预测,再应用受试者工作特征曲线（ROC）分析风险预警效果。阈值P均设为0.05。

2 结果

2.1试验奶牛背景信息由表1可知,LO-LFI组奶牛产后7 d BCS均显著高于HI-LFI组（P＜0.05）,产后7～50 d的体况损失极显著高于HI-LFI组（P＜0.01）,日均产奶量极显著低于HI-LFI组（P＜0.01）。2组奶牛年龄、胎次、50 d BCS、前胎次泌乳量无显著差异（P＞0.05）。结果表明,低LFI奶牛泌乳早期体况损失增大,日均产奶量降低。

表1 LO-LFI和HI-LFI奶牛临床背景信息

2.2试验奶牛繁殖信息由表2可知,LO-LFI组奶牛在首次发情天数、配妊天数和产犊间隔均极显著地高于HI-LFI组奶牛（P＜0.01）,输精次数显著地高于HI-LFI组奶牛（P＜0.05）；LO-LFI组奶牛发情次数、发情率和受胎率均显著地低于HI-LFI组奶牛（P＜0.05）；初配天数无显著差异（P＞0.05）。结果表明,奶牛产后低LFI会延长首次发情天数、配妊天数和产犊间隔,增加输精次数,降低发情次数、发情率和受胎率,从而降低奶牛繁殖性能。

表2 LO-LFI和HI-LFI奶牛繁殖性能

2.3试验奶牛的卵泡生长状况由表3可知,LOLFI组奶牛产后50～55 d的卵泡生长速度极显著地低于HI-LFI组奶牛（P＜0.01）,但2组试验奶牛50 d和55 d的卵泡直径均无显著性差异（P＞0.05）。结果表明,奶牛产后低LFI会阻碍产后50～55 d卵泡的生长发育。

表3 试验奶牛产后50,55 d的卵泡直径及生长速度

2.4产后21 d不同LFI奶牛血中氧化应激指标的比较由表4可知,LO-LFI组奶牛SOD、GSH极显著低于HI-LFI组奶牛（P＜0.01）,抑制羟自由基能力显著低于HI-LFI（P＜0.05）。结果表明,奶牛低LFI会伴随氧化应激指标升高而抗氧化应激指标降低。

表4 产后21 d HI-LFI和LO-LFI组奶牛血浆中氧化应激指标含量

2.5产后21 d不同LFI奶牛血浆能量代谢指标、矿物质指标的含量由表5可知,LO-LFI组奶牛血浆中BHBA极显著高于HI-LFI组（P＜0.01）,NEFA显著高于HI-LFI组（P＜0.05）,而Glu却极显著低于HI-LFI组（P＜0.01）。2组Ca、P、Mg并无显著差异（P＞0.05）。结果表明,奶牛低LFI呈现出能量代谢紊乱的特征。

表5 产后21 d HI-LFI和LO-LFI组奶牛血浆能量代谢指标、矿物元素的含量 mmol/L

2.6产后21 d不同LFI奶牛血浆激素指标的含量由表6可知,LO-LFI组奶牛血浆中GH极显著低于HI-LFI组（P＜0.01）,E2、P4和IGF-1显著低于HI-LFI组（P＜0.05）。结果表明,低LFI的奶牛体内与卵泡发育或发情相关的激素含量显著降低,易发生卵巢静止。

表6 产后21 d LO-LFI和HI-LFI奶牛血浆激素指标

2.7LFI对奶牛发生卵巢静止的风险评估为了明确奶牛LFI与卵巢静止之间的关系,本研究采用队列研究中M-Hχ2检验来分析高低LFI组奶牛卵巢静止发生状况及其风险因素。结果如表7和表8所示,LO-LFI组奶牛发生卵巢静止的比例（36.67%）显 著 高 于HI-LFI组（10.00%）（P＜0.05）；其中,RR值为3.67,大于3.0且95%置信区间（1.10～12.20）不包括1,有显著的统计学意义（χ2M-H＝4.49,P＝0.03）。根据表9中所对应的关联强度,RR值在3.0～9.0之间是强的正关联。

表7 奶牛肝功能指数与卵巢静止之间的关系

表8 队列研究的M-Hχ2检验

表9 RR值所对应的关联强度

结果表明,奶牛低LFI会让产后卵巢静止发生的风险增高2.67倍,是奶牛产后发生卵巢静止的重要风险因素。

2.8奶牛卵巢静止发生的风险预警评估使用SPSS 22.0软件建立二元Logistic回归模型,模拟LFI指标对卵巢疾病的预测性,采用向前LR的方法,综合检验中sig＜0.05则说明模型有意义。由表10和图1可知,与卵巢静止奶牛相关指标预警的分界值、敏感度、特异性和AUC。通过Youden指数确定卵巢静止奶牛的最佳预警值为LFI＜—3.15、敏感度为91.3%、特异度为57.1%、曲线下面积为0.81,具有较好的诊断意义。

表10 奶牛卵巢静止诊断的LFI的分界值及其参数

图1 卵巢静止奶牛血浆LFI的AUC

3 讨论

3.1围产期不同LFI奶牛血液氧化应激、能量、矿物质,激素指标分析通过围产期对不同LFI奶牛血液氧化应激指标含量进行对比。低LFI奶牛血中SOD含量偏低。SOD能够清除过多的氧自由基,是机体的主要抗氧化剂[14],奶牛发生氧化应激时SOD可阻止氧自由基损伤细胞结构和功能,避免细胞受到氧化损伤,低LFI奶牛血浆中SOD含量较低,此时发生氧化应激,氧自由基的清除速度减慢。血液中GSH起着直接或间接的抗氧化作用,包括基因表达调控,酶活性或代谢调节,对细胞的保护、氨基酸转运、免疫功能调节[15]。本试验结果表明,LO-LFI奶牛血液GSH含量显著提高,提示了围产期奶牛健康和生产性能和血液中GSH含量有重要关系。另外,SHARMA等[16]研究表明,奶牛产后前2周血液中的高BHBA环境会引起氧化应激和免疫抑制,血液中抑制羟自由基含量下降。本研究中,LO-LFI奶牛血液中BHBA显著增加并且抑制羟自由基含量显著减少,与先前报道结论相符合,表明奶牛LFI下降同时伴随血液清除自由基能力减弱,加重氧化应激,对奶牛健康造成不利影响。

将围产期不同LFI奶牛能量、矿物质指标进行对比,低LFI的奶牛呈现出高BHBA和NEFA,低GLU的血液生理特征。BHBA由肝脏产生[17],约占酮体总量的70%。一般情况下,体内的BHBA含量很低。在奶牛泌乳早期,机体能量的需求增加,日粮能量摄入不足以应对,从而大量动员脂肪组织,并释放大量NEFA转移至肝脏,当超过肝脏利用能力时,便转化为大量酮体,诱发酮病,此时身体进入营养代谢紊乱状态。已有大量报道证实,能量负平衡,影响肝脏功能,并是奶牛产后繁殖性能下降的重要风险因素[18]。营养物质也可以同时作用于卵巢并影响卵泡发育,甚至葡萄糖、脂肪酸和代谢激素可以刺激卵泡发挥功能[19]。

E2与P4都属于类固醇类激素。一方面,高脂高胆固醇可引起肝脏脂肪变性,并引起类固醇激素合成紊乱[20]。另一方面此时机体营养代谢紊乱,通过代谢中间体或饮食营养直接影响下丘脑-垂体-卵巢轴,影响卵泡发育[21]。IGF-1由肝脏产生,游离的IGF-1与受体结合后可以促进脂肪合成,使NEFA降低,并且具有降血糖、促进物质代谢、促进生长发育等生理功能[22]。IGF-1一直被认为是GH作用的主要介质,而垂体释放的GH和肝脏产生的IGF-Ⅰ间建立了负反馈机制,即IGF-1可通过刺激生长抑素的分泌和抑制GH基因表达来抑制下丘脑GH的分泌。同时,IGF-1、葡萄糖、皮质醇和游离脂肪酸等可降低生长激素水平[23-25]。在本试验中,LO-LFI的奶牛GH、IGF-1均下降,高浓度的NEFA可能降低了GH水平,导致IGF-1水平受GH与肝脏损伤的双重抑制。不足的IGF-1无法进一步促进脂肪合成,降低NEFA,进而形成恶性循环。

3.2奶牛卵巢静止的预警评估使用血液分析来评估奶牛的代谢健康已经被视为非常有效的方法,例如利用血液中能量标志物BHBA、NEFA来评价围产期奶牛的酮病发病情况,进而准确判断奶牛是否健康。许多研究表明,围产期奶牛的健康状况对奶牛的繁殖性能有重要影响。先前有研究利用能量状态的生物标志物对卵巢静止进行风险预警,例如有研究已经得出产后奶牛血浆中NEFA＞0.585 mmol/L,血浆Ca2＋＜2.225 mmol/L时,奶牛患卵巢疾病的风险将大幅增加[26]。也有研究利用围产期血液中的单一指标如AST、Mg2＋等进行预测,例如,钱伟东等[27]报道,当奶牛血液中AST＞77.0 U/L,Mg2＋＜0.57 mmol/L时,奶牛卵巢静止的风险增高。然而,这种方法也是通过单一指标进行的分析,没有将多种指标进行联合预警分析。为了能更好的对卵巢静止发生风险进行早期预警,本试验选择了产后3,28 d血浆指标进行分析,提高了诊断的价值和特异性。利用Spearman相关性分析和二元Logistic回归模型得出LFI指标与卵巢静止的早期预警相关。而后,利用ROC分析界定了卵巢静止奶牛血中LFI＜—3.15时,奶牛会在产后患卵巢静止的风险增高。因此,牛场应该在日常管理中定期对泌乳早期奶牛血液进行采样,对血中白蛋白,总胆固醇和总胆红素（计算LFI值）进行采样检测,如检测指标超出预警值时,表明奶牛患卵巢静止的风险大大增加,应当在日常的管理和饲养方式上进行改变,从而预防卵巢静止的发生。

奶牛产后低LFI是卵巢静止发生的重要风险因素。此时伴随着机体能量代谢紊乱、氧化应激增加而抗氧化应激能力减弱、生殖激素水平降低。而且ROC分析结果表明,奶牛LFI可以作为奶牛产后卵巢静止发生风险的潜在预警指标,当奶牛LFI＜—3.15时能够早期预警奶牛卵巢静止,为今后奶牛产后乏情的预测提供了科学依据。