不同发育阶段牦牛睾丸组织miRNA的分析及鉴定

袁钰洁,周婧雯,殷 实,杨柳青,秦文昌,李 键,2,3* （.西南民族大学 畜牧兽医学院,四川成都 6004；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室,四川 成都 6004；3.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川 成都 6004；4.西南民族大学 现代生物技术国家民委重点实验,四川 成都 6004）

睾丸发育以及精子发生的顺利进行是哺乳动物维持种群繁衍的基本条件,其受到多种基因的调控[1]。miRNAs是长约22 nt的一类非编码短链RNA,可以通过与m RNAs的3′UTR区域的碱基互补,实现其基因调控的功能[2]。miRNA合成的步骤包括初级转录本（primary miRNA）转录、前体miRNA（miRNA precursor）形成、前体miRNA转运、双链miRNA产生和成熟等[2]。DICER是核糖核酸酶Ⅲ（ribonucleaseⅢ）家族的成员,在细胞质将前体miRNA加工成22 nt左右的成熟miRNA[3]。有研究敲除了小鼠原始生殖细胞的Dicer基因,发现其原始生殖细胞和精原细胞增殖、分化受限,导致精子生成障碍[4],提示miRNA在生殖细胞的发育过程中发挥了重要作用。多个miRNA已被报道参与精子发生的调控,例如miR-20通过下调精原干细胞发育的关键转录因子STAT3的表达促进小鼠精原干细胞自我更新[5],miR-let-7家族成员可通过调节与促进细胞增殖分化相关的IGF1信号通路促进小鼠精原细胞分化[6],以保障有丝分裂的顺利进行。miR-34c通过抑制重要的转录激活因子ATF1的表达影响BCL-2/BAX基因表达,促进小鼠雄性生殖细胞凋亡[7]。由此看来,miRNA能够通过调控精子发生过程中关键基因的表达保障这一过程顺利进行。

迄今为止,已有多个研究分析了各物种不同发育阶段睾丸组织miRNA的表达谱。YAN等[8]研究比较了性成熟前后小鼠睾丸的miRNA表达谱,发现19个差异表达的miRNAs,其中miR-181a及miR-181b在成熟睾丸中的表达上调,其靶基因RsbnⅠ被证实参与单倍体生殖细胞的转录调控。何良军[9]在研究哈萨克马驹（5月龄）、周岁马（1.5岁）和成年马（3～8岁）的睾丸miRNA表达谱后,发现周岁马和成年马相比,miR-34b和miR-34c的表达量显著升高,表明miR-34b和miR-34c可能促进精子发生。白曼[10]构建了小尾寒山羊睾丸不同发育阶段（性成熟前（2月龄）、性成熟（6月龄）和体成熟（12月龄））miRNA表达谱,筛选出29个与睾丸发育和精子发生相关的关键基因（CA3、APOH、SYT6等）。

牦牛（Bos grunniens）是分布于青藏高原及周边地区的特有牛种,能为牧民提供优质的肉、乳等产品。但牦牛生长速度缓慢、性成熟晚、繁育能力较低的特性,很大程度上阻碍了牦牛产业的发展。因此,针对牦牛精子发生过程中的分子机制进行研究,对于提高牦牛的繁育能力,具有重要的研究和生产指导意义[11-12]。此前关于睾丸组织miRNA表达谱的研究主要集中在胚后发育阶段,对于出生前后牦牛睾丸发育过程中的miRNA的种类、特征及其发挥的作用仍然不清楚。本研究利用RNA-Seq技术对胎儿期（4～5月龄）、犊牛期（1岁）和性成熟期（3岁）牦牛睾丸组织中的miRNA进行高通量测序,并且对测序获得的miRNA的结构、功能和分布进行分析,探讨了miRNA对牦牛精子发生的调控作用。

1 材料与方法

1.1实验动物与样本采集样本采自四川省成都市青白江屠宰场,采样器材均提前使用DEPC水浸泡处理。选择健康的雄性牦牛,根据年龄将其分为3组:胎儿期（4～5月龄）、犊牛期（1岁）和性成熟期（3岁）,来自同一年龄组的2头牦牛视为生物学重复。实验动物经颈部放血处死后,用DEPC水处理过的剪刀摘去双侧睾丸及其周边组织（胎牛睾丸采用外科手术去势的方法采取）,移除附睾、脂肪垫,将睾丸组织修剪为约1 cm×1 cm×0.5 cm的小块后放入含有RNA laterTM的离心管中,立即投入液氮罐中,并在1 h内运至实验室—80℃冰箱中保存备用。

1.2主要仪器及试剂分光光度计（NanoPhotometer-N60,Implen公司）；荧光定量仪（Qubit2.0,Life Technologies公司）；生物分析仪（Agilent 21,安捷伦公司）。RNA laterTM（AM7020,Invitrogen公司）；TRIzol（15596026,Invitrogen公 司）；miRNA First Strand cDNA Synthesis（Tailing Reaction）试剂盒（B532451,生工公司）；Real-time PCR Master（ROX）（Real-time PCR 2×mix）（04913914001,Roche公司）。

1.3Small RNA(sRNA)文库构建、质检与测序TRIzol法分别抽提6个睾丸组织的总RNA,采用NanoPhotometer-N60检测RNA的纯度（D260/D280及D260/D230的比值）和浓度,用Qubit2.0对RNA浓度进行精确定量,通过Agilent 2100检测RNA的完整性。合格后的样品用Small RNA Sample Pre Kit分别构建6个测序样本的cDNA文库,库起始RNA为3μg的,首先在其3′和5′端加上测序接头后反转录成cDNA,然后进行PCR扩增,再用8%的聚丙烯酰胺凝胶纯化PCR产物,筛选140～160 bp的DNA片段进行胶回收,最后利用Illumina Hiseq 2500平台进行测序[13]。

1.4总RNA提取、miRNA反转录及荧光定量PCR用TRIzol法分别提取牦牛不同发育阶段睾丸组织的总RNA,一部分保存在—20℃,根据miRNA First Strand cDNA Synthesis（Tailing Reaction）试剂盒说明进行加尾与反转录,反应体系:2×miRNA RT Solution mix 10μL,miRNA RT Enzyme mix 2 μL,RNA模板2μL,RNase-free water 6μL。反应条件:37℃60 min,85℃5 min,所得cDNA稀释50倍后作为模板用于后续qPCR反应。

参 照miRbase 21.0（http://www.mirbase.org/）中miRNA的成熟序列设计特异性引物,引物由上海生工合成,引物信息见表1。采用SYBY Green染料法对miRNA测序结果进行验证,以U6基因作为内参,参照miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit（SYBR Green）说明进行qPCR检测,反应体系:2×miRcute Plus miRNA Premix（with SYBR&ROX）10μL,上、下游引物各0.4μL,miRNA第1链cDNA 2μL,dd H2O 8μL。反应条件:95℃15 min；94℃20 s,64℃30 s,共40个循环。

表1 qPCR引物序列

1.5miRNA测序数据分析利用Illumina's Genome Analyzer处理原始数据（raw reads）。首先去除原始数据中的低质量reads,保留高质量reads,去除以下情况的reads:含无法确定碱基信息量大于10%、被5′末端接头污染、无3′末端接头及荧光标记以及含有poly A/T/C/G的,最终获得过滤后的数据（clean reads）。将上述clean reads与miRbase 21.0（http://www.mirbase.org/）数据库进行比对,按已知miRNAs＞r RNAs＞t RNAs＞sn RNAs＞snoRNAs＞重复序列＞基因区＞新miRNAs的顺序对每一条sRNA进行唯一注释。整合miREvo和miRDeep2等miRNA预测软件进行新miRNA的分析。通过GO分析对miRNA靶基因进行功能预测。对各样本中所有miRNA进行表达量的统计后用TPM（transcript per million）进行表达量归一化处理[14-16]（TPM＝reads（sRNA）/total reads×106）。

1.6数据分析利用DESeq R软件（版本:1.8.3）对2个比较组合之间的（2个生物学重复为一组）的miRNA进行差异表达分析,Benjamini-Hochberg法校验P值。采用One-way ANOVA（Tukey's multiple comparison test）对各年龄段间miRNA数目进行统计,统计结果以x±s x方式表示,用2—△△Ct法计算miRNA相对表达水平,SPASS19.0软件进行显著性分析,P＜0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1不同发育阶段牦牛睾丸中不同长度RNA的分布和miRNA的比例分析利用高通量测序技术,获得了不同年龄阶段牦牛睾丸组织的短链RNA文库。通过数据过滤后,得到21 449 421±2 655 045条（±s,胎儿期）、18 448 417±731 001条（犊牛期）及17 594 901±1 126 590条（性成熟期）待分析数据（表2）。

表2 测序数据质控结果

miRNA一般长22 nt左右,在3′端可有1～2个碱基的长度变化。在胎儿期文库中,在22 nt的序列所占比例多达（59.95±4.09）%,明显高于其他长度的比例。而犊牛期和成年期库中22 nt的序列占比分别是（11.14±1.67）%和（8.75±3.21）%（图1）。

图1 不同发育阶段牦牛睾丸中不同长度sRNA的分布

对所有sRNA与各类RNA的比对、注释情况进行分析发现,胎儿期已知miRNA占已知小RNA总数的比例（67.45±2.78）%,显著高于犊牛期（12.15±4.16）%与性成熟期（7.45±2.08）%（P＜0.05）（图2）。

图2 不同阶段牦牛睾丸中miRNA数目占sRNA总数的比例

2.2测序miRNA表达验证为验证测序数据的准确性,随机选择表达趋势不同的6条miRNA:btamiR-375,bta-miR-493,bta-miR-370,bta-miR-320a,bta-miR-449a,bta-miR-339b。进行qPCR验证,结果显示6条miRNA在qPCR和测序数据中的表达趋势均保持一致,表明测序结果真实可靠（图3）。

图3 miRNA测序数据验证

2.3牦牛睾丸组织中miRNA碱基偏好性分析不同发育阶段牦牛睾丸中不同长度的miRNA首位碱基均表现为明显的U（尿嘧啶）偏好性（图4A）。对miRNA序列各个位点的碱基偏好性统计发现,除首位外,在第5,10,18,19,20,22位也表现出明显的U偏好性。在第2,7,9,12,17位表现出C（胞嘧啶）偏好性,在第3,8,11,13,15,16位具有A（腺嘌呤）偏好性,在第4,6,14,21位具有G（鸟嘌呤）偏好性（图4B）。

图4 不同长度miRNA碱基偏好性分析

2.4不同阶段牦牛睾丸中新miRNA预测与结构分析不同发育阶段牦牛睾丸中预测的新miRNA数目如表3所示,共计发现新miRNA成熟体77个,新miRNA前体共80个,其中N-TE-1（N-TE-2）中发现成熟体及前体最少,分别为39和41个,M-TE-1中发现成熟体及前体较最多,分别为52及47个。

表3 新miRNA成熟体及前体数量统计

本研究发现的新miRNA首位碱基偏好性与已知miRNA有很大差异:在胎儿期,18～22 nt的miRNA首位碱基具有C偏好性；在性成熟期,19～21 nt的RNA首位碱基具有U偏好性,18 nt的miRNA首位碱基具有G偏好性,22 nt的miRNA具有C偏好性（图5）。

图5 不同阶段牦牛睾丸新miRNA首位碱基偏好性示意图

2.5miRNA差异表达分析通过比对3个比较组合间的差异表达miRNA发现,胎儿期与犊牛期差异表达miRNA共224个,犊牛期与性成熟期差异表达miRNA共36个,胎儿期与性成熟期差异表达miRNA共239个（图6）,在3个阶段间均有差异表达的miRNA共13个（表4）。

表4 在不同发育阶段牦牛睾丸中均显著差异表达的miRNA

图6 不同发育时期牦牛睾丸中显著差异表达miRNA的数目分布

2.6靶基因的GO分析对不同发育阶段牦牛睾丸样本之间所有显著差异表达的miRNA靶基因进行GO富集分析,从生物过程（biological process）及其子条目上富集的基因个数的分布情况进行分析,miRNA靶基因的数目在生物学过程排在前5位的分别是:代谢过程、胞内蛋白质修饰过程、磷代谢过程、含磷化合物代谢过程及细胞内信号转导（图7）。

图7 GO功能富集分析

根据GO分析结果,在显著差异表达的miRNA靶基因中筛选出与减数分裂、精子发生、精细胞发育与分化及精卵识别相关的靶基因共20个（表5）。

表5 与精子的发生或功能相关的靶基因及相关的显著差异表达的miRNA

3 讨论

miRNA是一类分布于生物机体内的小分子非编码RNA,广泛参与各类生物学过程,在细胞增殖、分化、发育、凋亡和代谢等过程具有调控作用的基因中,有30%以上直接受到miRNA的调控[17-18]。miRNA在睾丸发育与精子形成过程中发挥了重要作用,已有研究对不同发育阶段小鼠、哈萨克马和猪睾丸组织的miRNA表达谱进行分析[10-11,19],但这些研究主要集中在胚后发育阶段,对参与胚胎期睾丸发育的miRNA及其种类及功能仍然了解不足。本研究对牦牛胚胎期（4～5月）及胚后（1岁,3岁）不同发育时期睾丸中的miRNA进行测序,并对其结构、功能和分布的特征进行了分析,为进一步研究miRNA在牦牛睾丸发育中的调控机制及揭示精子发生过程中的分子机制奠定了一定基础。

续表5

核苷酸序列的碱基组成对其理化特征有重要影响,因此分析miRNA的碱基偏好性有助于了解其生物功能。据报道,miRNA的5′端具有明显的U的偏好性,这种偏好性与miRNA的形成以及其对靶基因的沉默机制有关,与不同时期猪睾丸miRNA鉴定分析结果一致[19-21]。本研究发现,牦牛不同阶段18～22 nt的miRNA具有U的首位碱基偏好性。对新miRNA而言,发现胎儿期18～22 nt和性成熟期22 nt的miRNA片段首位碱基具有C偏好性,这可能是由于新miRNA的形成或对靶基因的调控存在未知的机制。

能量代谢是维持个体各项生物学过程的基础条件,精子的发生与成熟同样离不开能量代谢[22-23]。对牦牛不同发育阶段miRNA的靶基因进行GO分析,结果显示大量显著差异表达的miRNA靶基因与细胞代谢相关,涉及到细胞各类代谢所需的酶或酶的前体,例如精母细胞、精子细胞糖代谢所主需的乳酸脱氢酶（LDH）,生精细胞与精子进行有氧呼吸的关键酶琥珀酸脱氢酶[22],以及在调节精子运动方面发挥重要作用的可溶性腺苷酸环化酶（s AC）[24]等。以上结果提示在牦牛睾丸发育过程中miRNA很可能通过调节细胞代谢过程来维持精子发生的正常进行。

本试验结果表明,出生后胎儿期牦牛睾丸中miRNA数目占sRNA总数的比例（67.45±2.78）%远高于胚后发育阶段的1岁（12.15±4.16）%、3岁（7.45±2.08）%。据报道,牛睾丸中的精原干细胞在胎儿期（4～5月龄）时含量丰富,个体出生后逐步分化为其他细胞而使自身数目显著减少[25]。SOHLH2是本研究发现的与精子发生相关的miRNA靶基因之一,据报道其在精原细胞中与SOHLH1共表达,通过调控Kit启动子的活性来控制精原细胞的分化[26-27]。在小鼠精原细胞到精母细胞中均可检测到SOHLH2基因的mRNA[26-27],但在精原干细胞中该基因不表达[27-28]。此外,SOHL H2还被发现影响精母细胞减数分裂中相关基因的表达[29-30]。除此之外支持细胞的增殖分化也主要发生在胚胎期睾丸中,本研究预测的miRNA靶基因之一ID2所编码的蛋白是DNA结合蛋白（ID）抑制剂家族的成员,并参与细胞增殖和分化的调控。有研究表明,ID2可能参与支持细胞的分化和激素调节[31]。并且,ID2是一种精子发生调节剂,若将其表达水平人为上调,则会导致精子发生过程中粗线期精原细胞发育被抑制[32]。据此推测胚胎期牦牛睾丸中miRNA数量较多可能是由于miRNA在该阶段睾丸精原细胞及支持细胞的增殖分化中扮演了重要的角色。

此外,GO分析表明有多个显著差异性表达miRNA的靶基因与精子发生有关。apoE基因编码载脂蛋白E（apoE）与精子发生有关,apoE在精子所需脂质成分的转运中具有重要作用,也是性激素合成的核心脂蛋白。在针对叙利亚仓鼠睾丸组织中apoE的毒性试验中发现,经过药物处理后的仓鼠睾丸细胞内胆固醇的运输受阻,导致异常的性类固醇生物合成,从而导致仓鼠生精缺陷[33]。SYCE3与精原细胞的减数分裂相关,SCHRAMM等[34]敲除小鼠Syce3基因,发现SYCE3丢失后减数分裂会正常启动,却会停滞于分裂期,无法完成分裂,所以SYCE3对于精子的生成至关重要。由此推测,miRNA在牦牛精子生成的各个阶段均发挥着重要的生理作用。

本研究对胚胎阶段（4～5月龄胎牛）与胎后阶段（1岁、3岁）牦牛睾丸组织中的miRNA进行高通量测序与分析,结果表明牦牛睾丸发育过程中,胎儿期的miRNA占sRNA的比例显著高于胚后阶段（犊牛期与性成熟期）；新miRNA与已知miRNA相比可能存在未知加工机制；大量显著差异表达的miRNA靶基因与细胞代谢相关,部分miRNA的靶基因与精子发生或其功能密切相关。本研究为进一步探索miRNA对牦牛睾丸发育的调控机制提供了基础数据,并对改善牦牛的繁殖性能具有一定的参考价值和指导意义。