肠-肝轴:肠道微生态与动物肝脏疾病

孙智媛,陈凤鸣,钟颂石,梅力文,李颖慧,2,3* （.湖南农业大学 动物科学技术学院,湖南 长沙 4028；2.湖南家禽安全生产工程技术研究中心,湖南 长沙 4028；3.湖南畜禽安全生产协同创新中心,湖南 长沙 4028）

在生命的早期,肝脏作为前肠的一个芽孢开始发育,成熟后肝脏和肠道通过门静脉和胆道系统相互关联。肝脏中约70%的血液来自门静脉,是肠道中营养物质和细菌产生的毒素及其代谢产物的接收器和过滤器,而肝脏的反馈途径则是分泌胆汁酸和抗体等物质进入肠道内,从而影响肠道稳态[1]。肝脏与肠道在解剖位置和生理功能上密切相关,两者在代谢、免疫和内分泌过程中广泛联系,相互协调,相互影响,这种双向作用被称为“肠-肝轴（gut-liver axis）”,也称作肠肝循环[2]。近些年来,越来越多的证据表明,肠-肝轴在多种肝脏疾病的发生、发展中都发挥着关键作用。当肠道遭受强烈打击时,固有肠道菌群紊乱和肠道屏障功能受损,导致肠道有害细菌移位,大量内毒素通过门静脉进入肝脏；同时,肝脏内的巨噬细胞（Kupffer细胞）等被这些内毒素激活,加速释放一系列促炎细胞因子,从而引发系统性炎症反应,加重肠黏膜损伤并对下游器官—肝脏产生不良影响[3]。随着“肠-肝轴”学说逐渐被认可,肠道和肝脏之间复杂的相互作用现已成为动物肝脏疾病发病机制和治疗应用中的研究热点。现围绕肠道微生态平衡的重要性以及肠-肝轴失调在动物肝脏疾病发病机制中的作用展开综述,探索通过恢复肠-肝轴稳态来防治肝脏疾病的新思路。

1 肠道微生态平衡的重要性

机体肠道中栖息着数量庞大、种类繁多的微生物,主要包括细菌、真菌、古菌、原生动物和病毒等,这些微生物具有可遗传和相对稳定的特点。SIMPSON等[4]研究发现,不同动物肠道中存在着不同的微生物菌群。猪、鸡、兔等单胃动物和人的肠道微生物以类杆菌、梭状芽孢杆菌、双歧杆菌、真杆菌、乳杆菌、肠杆菌科、链球菌、梭杆菌、消化链球菌和丙酸杆菌为主；而对于牛和羊等多胃动物,瘤胃中除了含有大量甲烷菌以外,主要是纤维降解菌、瘤胃球菌、丁酸里氏菌和类杆菌。肠道微生物菌群以一定的比例和组合形成了相互依存、相互制约的关系,同时菌群与宿主在长期的协同进化下相互适应以共生关系达到动态平衡[5]。作为一个独特的微生物器官,肠道菌群参与调节宿主的消化吸收、能量代谢、免疫反应、激素分泌等过程,形成宿主与微生物菌群的代谢互作和信号互导的形势,在维持宿主肠道微环境稳态中发挥重要作用,同时与动物正常的新陈代谢、生长发育、繁殖分化、体况维持等息息相关[6-7]。然而,当正常微生物菌群之间、正常微生物与其宿主之间的微生态平衡被打破,肠道微生物菌群结构便会由生理性组合转变为病理性组合,即微生态失衡,主要表现为菌群比例失调和细菌定位转移,这极易诱发或加重疾病,危害机体健康,甚至导致动物死亡[8]。

在生物进化过程中,机体肠道巧妙地形成了一个复杂而有序的屏障网络来抵御外界病原体和致病因子,尽可能避免肠道微生态失衡。肠黏膜屏障是目前研究肠道微生态平衡的一大热点。完整的肠道黏膜屏障主要包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障等4个部分,它们在功能上相对独立而又密切联系,共同保障机体各种生命活动有序进行[9]。机械屏障,由肠上皮细胞及其分泌物形成的黏液层、表面的菌膜和细胞间紧密连接等构成,是维持肠道屏障功能的结构基础,在抵抗外界环境中的病原体和有害物质入侵肠道的过程中起着关键作用[10]。一旦肠道微生态失衡,将引起致病菌过度增殖,增殖的致病菌直接损伤肠上皮细胞紧密连接,使肠黏膜通透性增高,造成细菌及其产物易位进入肠肝循环而致病[11]。肠黏膜化学屏障由肠上皮细胞分泌的黏液、消化液及肠腔内正常菌分泌的抑菌物质组成,它们不仅能调控机体代谢,还能直接杀灭有害菌,或者是通过促进肠道蠕动,阻止有害菌黏附于肠上皮细胞,从而抑制其在体内的生长和繁殖,有利于毒素及时排出体外[12]。机体近80%的免疫细胞都分布于肠道,肠黏膜作为畜禽免疫的一道重要防线,主要由肠道相关淋巴组织和肠道浆细胞分泌型抗体构成。肠道正常菌群能够刺激机体免疫系统发育和成熟,而菌群失衡时,致病菌分泌的免疫抑制性蛋白可致黏膜免疫失调[8]。以上3种屏障均涉及肠道微生物的异常增殖及易位,而这些肠道微生物便组成了肠黏膜生物屏障。在生理状态下,动物的肠黏膜上定植的乳酸菌和双歧杆菌等益生菌通过占位效应、营养竞争及分泌各种代谢产物和细菌素等途径参与生物屏障的形成。综上所述,确保动物肠道微生态平衡是机体抵御肠道病原菌和外界抗原感染的第一道防线,对于降低机体炎症和减少疾病发生至关重要。

2 肠-肝轴稳态与动物机体健康

2.1肠道菌群失衡诱发动物肝脏疾病作为一个“虚拟的代谢器官”,肠道菌群与脑、肾、心血管等多个肠外器官有着密切联系,近年来,肠-肝轴在肝脏炎症、纤维化和胆汁淤积等疾病发病过程中的作用更是备受关注[13]。据报道,肝病内毒素血症尤其是重型肝病的发生与肠道微生态变化密切相关[14]。健康状态下的肠道会通过四大屏障阻止细菌、内毒素等进入血液[15],但是肠道微生态失衡后,肠道细菌和内毒素可接触上皮细胞并穿透内黏膜层,造成肠道紧密连接受损,肠道中病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）和微生物相关分子模式（microbial-related molecular patterns,MAMPs）发生病理性移位,进而激发肝脏炎性反应,加重肝脏病情[16-17]。WU等[18]研究表明,急性坏死性胰腺炎导致小鼠肠道微生态紊乱,肠道中快速增殖的革兰阴性细菌会移位至肝脏等其他器官并使其受到感染。BENJAMIN等[19]研究发现,肝硬化大鼠的肠道细菌移位率较高,其肝肺综合征的发生率也随之升高。这主要是由于肝脏作为肠道内容物的接收器,能够通过激发自身免疫反应,有效识别并清除肠道致病菌,但肝脏发生疾病后则会阻碍Kupffer细胞清除移位的细菌[20]。值得注意的是,对于机体而言免疫是把双刃剑,肝脏中过度的细胞免疫反应可造成大面积的肝细胞损伤,甚至引发重症肝炎。SPADONI等[21]研究表明,麦胶性肠病患者的血清转氨酶浓度升高,反映出肝脏受到一定程度的损伤,这有赖于肠道菌群失调激发了下游组织肝脏的炎性反应。

那么,肠道微生态紊乱造成的细菌移位究竟是如何激发肝脏炎性反应的呢?众所周知,细菌占肠道微生物群的99%以上,是机体PAMPs的主要来源,而肝脏是Toll样受体介导下PAMPs的重要靶点[22]。PAMPs和MAMPs能够直接作用于肝细胞或肝脏固有免疫细胞,如Kupffer细胞或星状细胞,进一步诱发肝脏炎性反应,并对肝脏组织的抗病毒和抗凋亡过程产生不良影响[23]。Toll样受体（Tolllike receptors,TLR）和Nod样受体（NOD-like receptor,NLR）在革兰阳性菌的炎症信号转导途径中发挥着重要作用[24],肠道中发生的微生物移位正是通过这两类模式识别受体诱导肝脏巨噬细胞和Kupffer细胞与PAMPs、MAMPs结合,激活核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）,产生大量炎性细胞因子,诱导肝脏星状细胞纤维化,致使肝损伤[25],肠-肝轴工作机制见图1。大肠是反刍动物细菌移位的主要部位,一方面细菌能够通过TLR4介导的胞内转运机制进入肠道固有层诱发肠道急性炎症[26],另一方面也能够通过受损的肠黏膜屏障进入肠系膜脂肪组织引发局部炎症[27]。除此之外,膜联蛋白ANXA5与人肝癌临床相关性高,能够表达调控肝癌细胞体内外淋巴结转移,成为部分癌细胞和病原菌进入体内循环的一个关键靶点[28]。

图1 肠-肝轴工作机制

2.2肝脏分泌物影响肠道菌群平衡作为肠-肝轴中重要的“远端”器官,肝脏既能接收来自肠道的微生物,又能通过分泌胆汁和释放免疫球蛋白A（immunoglobulin A,Ig A）抗体来塑造肠道中的微生物群落[29]。胆汁酸是胆汁的主要成分,在肝脏中以胆固醇为合成原料,其主要作用是促进小肠对脂质、胆固醇和脂溶性维生素的吸收[30-31]。胆汁酸通过顶端钠依赖性胆汁酸转运体（apical sodium-dependent bile acid transporter,ASBT）被主动吸收入小肠黏膜细胞中,然后与回肠胆汁酸转运蛋白（ileum bile acid transporter,IBAT）结合并吸收入门静脉,在回肠末端被重新吸收后,再被肝脏回收并将其分泌回肠道,完成胆汁酸的肠肝循环[32-33]。大多数动物体内的胆汁酸经过一个肠肝循环后,会消耗掉其总量的5%左右[34]。

胆汁酸因其具有两亲性而能作为表面活性剂,通过引起肠道细菌细胞膜损伤,破坏蛋白质和DNA的正常功能,例如能导致热应激休克蛋白等分子伴侣变性,使菌体内新合成的蛋白质无法正常折叠,从而导致细菌（尤其是革兰阳性菌）死亡[35-36]。ISLAM等[37]研究表明,胆汁酸的抗菌能力还与其结构和疏水性密切相关,含有2个羟基的胆汁酸对菌体细胞的损伤能力往往更强,而疏水性胆汁酸对细菌细胞膜磷脂双分子层的亲和力通常更高,故对细胞膜的破坏性更强；另一方面,胆汁酸还能与细菌内外的钙离子和亚铁离子等重要离子螯合,通过影响细菌的基因表达以及运动、分裂和趋化作用来抑制其增殖[38]。此外,肠道内的胆汁酸能被肠道细菌的去结合作用、差向异构作用和脱羟基作用转变成为次级胆汁酸[39],激活法尼醇X受体（farnesoid X receptor,FXR）和G蛋白偶联受体5（G protein-coupled receptor 5,TGR5）,诱导促炎细胞因子的表达,调节宿主体内的免疫和代谢途径,从而间接影响肠道菌群组成,发挥抗菌、修复肠黏膜损伤的作用[40-43]。肝脏疾病往往会引起胆汁酸的代谢紊乱[44],更重要的是前人的研究发现肝损伤患者的肠道变形杆菌和梭杆菌比例随之升高,拟杆菌比例降低,而肝硬化患者的肠杆菌和肠球菌水平升高,双歧杆菌水平显著降低[45]。乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭患者肠道的乳酸杆菌和双歧杆菌以及血清Ig A、免疫球蛋白G和T淋巴细胞亚群水平均显著降低,即表现出肠道菌群失调和机体免疫失衡[46]。

3 动物常见的肝脏疾病

硒缺乏症是由于动物饲粮中硒含量不足而引发的一种常见疾病,以肝脏代谢紊乱和免疫功能降低为主要特征[47]。更深入的研究表明,饲粮中添加适量的硒能够增加肠道菌群丰富度,并提高肝脏抗氧化能力；而当硒含量不足时,则会引起动物肠道菌群紊乱,导致细菌等产物移位至肝脏,诱导肝脏炎症反应,这符合肠-肝轴的工作机制[48]。ZHANG等[49]通过给生长猪连续饲喂低硒日粮,8周后成功建立了猪的缺硒模型,并发现模型猪肝脏中多种抗氧化酶的活性被抑制,肝脏发生氧化应激,伴随着细胞凋亡增多,肝脏表现为明显的坏死性损伤。当肝脏合成硒代蛋氨酸受阻时,会引发鸡的硒缺乏症,使肠黏膜免疫细胞中重要的效应细胞—肥大细胞发生氧化应激,造成空肠平滑肌细胞损伤,肠黏膜增厚、充血[50]。刘春朋等[51]研究发现,若鸡饲粮中硒含量不足,除了十二指肠中呈现出高水平的诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）之外,鸡的肝脏中iNOS和NO水平也同步升高,并且造成肠道和肝脏的双重氧化损伤,这提示我们肠道和肝脏之间存在一定的物质交换和信息交流（crosstalk）。

黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）中毒可引起肝脏急性炎症反应,门静脉中也可检出高浓度的炎性细胞因子[52]。门静脉作为肠道和肝脏之间的一条“高速通路”,其中的炎性细胞因子能够双向作用于肠道和肝脏,加剧2个部位的炎性病变。ZHOU等[53]给大鼠服用5,25,75μg/kg的AFB1,4周后大鼠肠道表现出了不同程度的微生态失衡,粪便中短链脂肪酸的水平显著降低,而胆酸、亚油酸和丙酮酸含量显著提高。在给断奶仔猪饲喂了含有0.3 mg/kg AFB1的日粮21 d后,仔猪肝小叶结构出现轻度损伤和纤维化,伴随着盲肠双歧杆菌数量减少和空肠绒毛高度降低[54]。由此可见,AFB1引起的动物中毒和肝脏炎症很可能与肠道及其微生态息息相关,这或许是肝脏疾病防治的一个重要靶点[52]。

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）可以从脂肪变性发展为非酒精性脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化,最终发展为癌症,而肠道菌群失衡和肠道内容物移位均会直接促进这一进程的发展[55]。MIELE等[56]研究发现,NAFLD患者尿液中51Cr-EDTA水平显著升高,十二指肠绒毛处ZO-1染色强度增加,肠道通透性与其肝脏脂肪变性程度存在明显相关性,NAFLD患者肠道通透性显著增加且内容物移位发生率升高。更有研究表明,肠道中微生物群的改变引起的肠道环境的变化,如不饱和脂肪酸转变为饱和脂肪酸,能够改变胆汁酸代谢,进而提高NAFLD的发病率[57]。赵南南[58]研究发现,妊娠期和泌乳期日粮中添加甜菜碱能够提高新生仔猪肝脏胆固醇含量,而不影响甘油三酯水平,并通过改变机体DNA甲基化调控肝脏的脂质代谢,从而缓解NAFLD。这与THILAKARATHNA等[59]和MIRO-BLANCH等[60]的研究结果相符,肠道中益生菌对宿主基因的遗传调控,如DNA甲基化和组蛋白修饰,有利于抑制宿主肝硬化的发生。益生菌嗜酸乳杆菌和双歧杆菌可以降低丙氧基甲烷诱导小鼠肝脏中癌基因miR-155、miR-221和Bcl-like2的表达,而且在饲喂了益生菌的小鼠中,抑癌基因miR-122和肿瘤抑制基因转录因子PU.1表达量升高[61]。这一结果提示,肠道微生物群能够通过调控宿主肝细胞基因表达进而影响肝功能,这可能是“肠-肝轴”的另一种重要表达形式。

4 益生菌调控肠-肝轴稳态防治动物肝脏疾病

益生菌作为一类对宿主有益的活性微生物,通过黏附作用定植于肠道,在调节肠道菌群稳衡上成效显著,现已得到广泛的认可与应用。近年来随着人们对肠-肝轴认识的逐步深入,益生菌对动物肝脏疾病的干预作用备受关注。一方面,益生菌够直接调节肠道菌群、改善肠壁屏障功能,降低肠黏膜通透性,有效减少门静脉中有害菌的含量[62-63]；另一方面,肠道内益生菌及其代谢产物能够通过门静脉到达肝脏,参与调节胆汁酸代谢,维持肝脏代谢功能并减少肝脏脂肪沉积[64]。AMOAH等[65]给对虾饲喂不同浓度的凝结芽孢杆菌,研究发现对虾肠道中以假单胞菌为主的有益菌明显增加,且随着日粮中益生菌浓度的增加,弧菌和光细菌等致病菌丰度显著下降,从而缓解了肠黏膜损伤。CHIVA等[66]采用约氏乳杆菌治疗肝硬化大鼠,结果表明益生菌的干预能够减少肠道肠杆菌及肠球菌的数量,并减少肠道细菌移位,降低血液中内毒素水平。DU等[67]和CHEN等（本团队未发表数据）分别在仔猪日粮中添加芽孢杆菌和德氏乳杆菌,研究发现这2种益生菌均能增强仔猪肠上皮屏障功能,抑制肠黏膜中NF-κB炎症通路的基因表达,降低TNF-α和IL-1α等促炎细胞因子表达水平；与此同时,还发现肝脏中细胞因子TNF-α和IL-1β含量也随之降低,这表明芽孢杆菌和德氏乳杆菌可能通过肠-肝轴减轻肝脏炎症反应。WANG等[68]给黄羽肉鸡日粮中添加了75 U/kg葡萄糖氧化酶和1×105CFU解淀粉芽孢杆菌,结果显示黄羽肉鸡的肠道紧密连接蛋白的表达得到提高,肝脏中血红素加氧酶-1、p53基因和BAX蛋白表达均显著降低,肝脏抗氧化能力得到改善,有助于抵御氧化应激等不利环境。以大鼠为研究对象发现黄曲霉毒素能够增加肝癌相关基因和细胞周期蛋白基因的表达,人类临床数据进一步表明,鼠李糖乳杆菌和费氏丙酸杆菌谢氏亚种能有效减少黄曲霉毒素的暴露,从而降低肝癌发生风险[69]。然而,从维护肠黏膜屏障功能入手,通过调控肠道微生态平衡,以期重建肠-肝轴稳态,将益生菌应用于动物肝脏疾病防治的临床效果尚需要更多的研究证实。

5 小结

近年来,大量基础研究和临床数据表明,各种肝脏疾病病程中往往伴随着肠道菌群紊乱。尽管肠道菌群的改变究竟是肝脏疾病的诱因还是结果尚不明确,但肠道菌群紊乱在人和小鼠的肝脏疾病发病机制中的作用被陆续报道,肠-肝轴作为畜禽等动物肝脏疾病的潜在调控靶点受到越来越多的关注。益生菌作为一类对宿主有益的活性微生物,有助于修复肠黏膜屏障功能、恢复肠道微生态稳态,还能产生抗菌肽类物质减轻炎症,是目前防治肝脏疾病发生的一种有效干预手段。然而,益生菌的种类繁多,且在宿主肠道中的稳定性较差,因而在畜禽等动物肝脏疾病方面的治疗作用机制仍有待更深入的研究。