细菌对抗菌药物敏感性检测方法研究进展

林施聘,赖文韬,姜中其 （浙江大学 动物科学学院,浙江 杭州 310058）

近年来,越来越多的病原菌对一种或多种抗生素产生耐药性,甚至出现超级细菌。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、耐万古霉素的粪肠球菌等耐药菌株的出现成为危害公共健康的缘由之一。据报道,预计到2050年,耐药菌的感染将超过癌症和心脏病,成为主要的病死原因[1]。此外,新抗菌药物的研发受到时间、成本等方面的限制。因此,临床兽医能够快速、准确地对患病动物做出诊断并开具处方对精准医疗有重大的意义。传统的药敏试验方法（antibiotic susceptibility testing,AST）依靠表型来确定待检菌对抗菌药物的敏感情况,比如扩散法、稀释法、E-test法,这些方法虽然准确、成本低、易操作,但是从预培养到分离纯化病原微生物,再到检测对药物的敏感性,整个过程长达48～72 h。因此,临床兽医常放弃传统药敏试验而根据可疑的病原菌结合当地的流行病学选择经验疗法以快速治疗患者。为解决这一现实问题,科学家们致力于开发快速药敏试验检测技术,以避免乱用、滥用抗生素。

通常情况下,药敏试验分为基因型AST和表型AST。基因型AST包括聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术、环介导等温扩增技术（LAMP）、下一代测序等,其优势主要包括两方面:一是可在短时间内完成检测；二是有些方法可直接对临床样本进行检测,无需繁琐的预处理。但也存在着一些问题,除了成本高、不能提供最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）外,基因型AST还容易出现假阳性或假阴性的结果。新兴的表型AST包括微流体技术、拉曼光谱、表面等离子体共振等,主要基于在给定的物理化学环境中将细菌的生长、形态等生理参数的变化转化为可测量的信号。而在抗菌药物的作用下细胞产生的生理变化要比细胞抑制更快（1 hvs1～2 d）[2],因此新兴的表型AST比传统药敏试验方法快速,但是其成本、可操作性、准确性有待进一步的验证与考量。

1 传统药敏试验方法

1.1扩散法扩散法主要包括纸片法、牛津杯法和打孔法,具有低成本、结果直观等优点,其中纸片法运用最广。纸片法的原理是将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有待检菌的琼脂平板上,由于药物会在琼脂平板上进行扩散并且随着距离的增加浓度会逐渐降低,最终根据培养基上出现的抑菌圈的直径大小判断待检菌对抗菌药物的敏感性[3]。但是,扩散法的试验结果受多种因素的影响,如培养基的厚度、抗生素含量等,加上试验中用到的试剂和耗材如培养基、药敏纸片等来源渠道各异,因此须实施质控监测,即在平行条件下将质控菌株与待检菌进行药敏试验。只有当质控菌株的抑菌圈在预测值之内时,待检菌的试验结果才可信[4]。

1.2稀释法稀释法是监测待检菌在含一系列二倍稀释抗菌药物的培养基中生长情况,其优势在于操作简便、重复性强等。稀释法可分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。琼脂稀释法利用固体培养基进行药物敏感性检测。将待检菌接种在含有抗菌药物的琼脂平板上并过夜培养后,未有细菌生长的琼脂平板对应的最小药物浓度即为MIC。肉汤稀释法可分为微量肉汤稀释和宏观肉汤稀释,其操作原理与琼脂稀释法相似,但换成了液体培养基[5]。

1.3E-test法与含有均等抗菌药物浓度的药敏纸片不同,E-test法所用到的非渗透性测试条的一端至另一端包被着浓度逐渐增高的抗菌药物。将检测条贴于琼脂平板表面时,药物经扩散会形成一个连续变化的浓度梯度,待检菌经培养后最终在平板上会形成抑菌圈,在抑菌圈与测试条的交界处所对应的抗菌药物浓度即为该药物对待检菌的MIC[6]。E-test法与纸片法相似,具有定量的优点,并且MIC的判别与稀释法相比更加直观,但是其成本较高。

1.4药敏自动检测系统目前主要有3种被广泛采用的药敏自动检测系统,分别为德国西门子的MicroScan Walk Away系统、法国梅里埃的VITEK系统和美国BD公司的Phoenix系列自动化仪器,均基于微量肉汤稀释法的原理设计。MicroScan Walk Away系统通过分光光度法检测细菌生长情况。VITEK系统可动态监测细菌生长情况,将生长速率与药物浓度作线性回归分析后判定MIC。Phoenix系统将刃天青作为氧化还原指示剂,通过检测还原态刃天青的荧光强度来判定细菌生长状况[3]。这3种自动检测系统的缺点是仪器体积庞大、不便携、昂贵、使用成本高,但优势在于严格遵循临床和实验室标准协会（CLSI）和欧洲委员会的抗菌药敏试验（EUCAST）指南。

2 新兴药敏试验技术

2.1基因型AST自1988年首次报道了使用热稳定聚合酶进行核酸扩增的方法以来[7],PCR技术发展迅速,包括普通PCR和实时荧光定量PCR。PCR技术根据DNA热变性原理,通过控制温度对特定区域的序列进行扩增。普通PCR技术可检测待检菌的耐药基因,但由于耐药基因的出现不总与耐药表型一致,且样品基质中所含的化合物可能会抑制扩增反应,容易导致假阴性或者假阳性的结果[8]。实时荧光定量PCR可准确定量样本中特殊核酸的拷贝数来测量细菌生长量,而不依赖于细菌耐药机制。LAMP利用4个引物和6个识别（退火）位点在60 min内产生高水平的扩增子。与仅使用2个引物的标准PCR相比,LAMP具有更高的特异性[9]。微阵列可将多个探针固定在固体或液体介质上,因此可以同时检测细菌基因组中与耐药基因相关的多个突变位点[10],其在分枝杆菌的鉴定及耐药基因的检测上的优势尤为明显[11]。PCR技术的主要优点是灵敏、快速,甚至可以直接对临床样本进行检测,但也有局限性,包括难以区分活细胞和死细胞,不能提供MIC,并且核酸扩增的阳性结果并不能证明有生命体的存在[12]。而下一代测序可通过对全基因组的测序来比较等位基因或分析单核苷酸多态性,从而预测细菌的耐药性[13]。

2.2基于光学的表型AST

2.2.1ATP生物发光测定法 ATP生物发光测定法的原理是基于萤光素酶利用ATP将荧光素氧化为腺苷酰氧化萤光素,最终形成的光强度与样品中的ATP成一定比例,从而检测细菌密度[14]。由于样本中存在游离的非细菌ATP,体细胞中所含的ATP等干扰因素的存在,该方法无法准确地进行定量检测。IVANCIC等[15]在检测临床尿液样本中的细菌载量时,先用体细胞提取剂来选择性地裂解宿主细胞以释放ATP,再用ATP酶来裂解宿主细胞的ATP以及游离的非细菌ATP,以提高检测的准确性,最终发现该方法可准确估计临床尿液样本中的细菌密度。

2.2.2拉曼光谱 拉曼光谱是一种非侵入性、无标记的可检测分子振动的技术,它由存在于待检菌培养液中的所有生物分子相对应的条带组成,这些条带代表着分子的物理化学特征。对拉曼光谱进行必要的校准后,观察添加抗生素前后所形成的拉曼光谱的区别,其中峰位置的侧移反映了细菌表型的生物生化或生物物理变化,而峰高的变化则反映了该峰代表的生物分子丰度的变化[16]。但是,拉曼光谱的灵敏度较低,可通过金属纳米粒子利用表面增强拉曼散射（surface-enhanced raman scattering,SERS）来解决这一问题。LIU等[17]展示了一种高灵敏度的SERS基板,即Ag纳米粒子嵌入的阳极氧化铝纳米通道,其利用这一技术来研究分别在苯唑西林和亚胺培南作用下的甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌和野生型大肠杆菌的拉曼光谱,结果显示,敏感菌的表面增强拉曼散射光谱在波数为730 cm—1处的峰值在2 h内有明显的下降,同时可以确定MIC。虽然SERS提高了拉曼光谱的灵敏度,但是其需要底物,且细菌通常被可能干扰细菌拉曼信号的不同底物包围,导致信号的实际变化太大。HONG等[18]开发了一项在单细胞水平上的拉曼散射成像技术,其利用正常葡萄糖和葡萄糖-d7培养基培养粪肠球菌并将细菌沉积在琼脂糖凝胶垫上,用CARS显微镜在C-D振动区域对单细胞进行成像,结果显示在添加万古霉素后,敏感菌株和耐药菌株在0.5 h内就表现出了不同的反应。

2.2.3表面等离子体共振 当光以一定的入射角与金属表层中的电子耦合时,电子会被激发而平行于金属表面移动以形成表面等离子体,能达到最大激发效率的入射角称为表面等离子体共振（surface plasmon resonance,SPR）角,而未耦合的部分则形成反射光。然而,耦合条件受到了与金属表面相邻材料折射率的影响。在SPR生物传感器中,将探针结合在金属表面,当目标分子与探针结合时,传感器的折射率发生变化,通过监测反射光或者SPR角的变化来检测目标分子与探针的相互作用[19]。将列阵技术与SPR成像（surface plasmon resonance imaging,SPRI）技术结合还可以进行高通量筛选。在SPRI技术中,入射角保持恒定,通过CCD摄像机监测反射光的强度变化来反映传感器的折射率变化。其中,CCD摄像机可以检测整个列阵的图像,从而提供每个列阵点的反射光信息[20]。然而,SPR传感器常用到的棱镜会限制成像系统的数值孔径及放大倍数,从而影响了空间分辨率。并且,样本和摄像机之间的相对运动在棱镜的影响下导致获取的图像发生改变,而物镜型SPR则可以解决这一问题。物镜型SPRI在扫描入射角时,样品和成像系统是固定的,并且可以通过使用高数值孔径和高倍率成像系统可保证成像光学的分辨率受到衍射限制,从而避免图像失真[21]。SYAL等[22]开发了一项等离子体成像和跟踪技术,可以在2 h内检测多黏菌素B对大肠杆菌O157:H7和尿路致病性大肠杆菌的MIC。该技术利用680 nm超级发光二极管来激发SPR图像,通过使用高数值孔径物镜（NA 1.49）和倒置显微镜对47 nm厚的金传感器芯片进行对比成像,并基于变化的等离子体图像对比度揭示细菌的纳米运动。结果显示,抗生素的作用能显著减慢敏感菌细胞的纳米级运动。

2.3基于电学的表型AST

2.3.1基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）分析样品时,需要将样品混合或包被于酸性基质中,当基质结晶时,包埋于基质中的样品发生共结晶,经激光束投射后电荷从基质转移至样品中,引起新电离粒子的解吸,接着在固定电场作用下由于质荷比的不同而相互分离,并用飞行时间分析仪测量离子穿过电场所需的时间来确定质荷比,最终生成肽质量指纹的特征图谱[23]。利用MALDI-TOF MS可通过不同的角度来分析待检菌的药物敏感性。首先,通过特征峰来分析细菌的敏感性,但是其局限性在于,只有当光谱数据库包含各属/种/亚种的菌株的肽质量指纹图谱时,才能鉴定分离株。其次,利用抗生素发生的变化（水解,脱羧,乙酰化）来确定其是否产生作用。例如,β-内酰胺类抗生素可通过水解而失活,加水使原始抗生素质量增加18 k Da,而脱羧作用使相对分子质量减少44 k Da。两者合计,与抗生素的原始质量相比损失26 k Da。但是当细菌通过除了酶以外的其他途径获得耐药性时,该方法无效[24]。再者,SPARBIER等[25]描述一种基于MALDI-TOF MS的非常通用的测定细菌的药物敏感性的方法,即用含同位素标记的氨基酸的培养基来培养细菌,其耐药性可从在含有同位素标记的氨基酸和抗生素的培养基中生长的细菌所产生的光谱推断,如果细菌具有耐药性,其质荷比m/z会变高。理论上,该方法基于细菌生长,因此不受制于任何耐药机制。

2.3.2介 电 电 泳 介 电 电 泳（dielectrophoresis,DEP）是一种无标记、低成本的诊断技术。在该技术中,带电或中性粒子的极化是由交流电或直流电产生的电场引起的,当粒子和周围介质具有不同的极化率时,会在电场中发生不同方向的运动。因此,可通过改变电场大小等因素来操纵粒子的运动。不同的细胞类型,处于成熟或增殖各个阶段的细胞以及患病的细胞的极化率均不同,所以可通过研究它们的介电电泳行为来区分细胞的状态[26]。当使用交流电时,常通过提高频率（大于100 Hz）来消除电渗透和电泳同时减少电化学反应,如气体的产生；而直流电介电电泳是近年来新开发的技术,通过使用绝缘体列阵来形成空间的不均匀性后施加电场,由于电极可以不与样本直接接触,该技术可以减少样本受到积垢、电解的影响,同时由于无需金属控件,设备制作更简单[27]。细菌经过电场的分选后可进一步观察细菌在抗生素作用下发生的形态学变化。SU等[28]开发了一种四电极阵列,其形成的非均匀电场是由函数发生器产生的。敏感菌经药物处理后比周围的介质的极化率高,被吸引到电场的强区域。相反,如果用无活性药物或无药物处理的细胞的极化能力不及周围介质,则被排斥到电场的弱区域。通过光学显微镜,结合CCD照相机和监视器屏幕,观察到细胞伸长、膨胀、裂解等。

2.3.3电化学传感器 电化学传感器由于其便携性、独立性和低成本而成为强大的分析工具,通常是基于细菌与相应受体结合后引起电信号的变化来研究细菌的生长情况。根据如何测量电信号的变化可将该传感器分为以下5类:（1）阻抗生物传感器。通过对工作电极施加电势脉冲来获取电流响应,从而检测工作电极-电解质界面的电容变化[29]。（2）安培/伏安生物传感器。多数利用细菌与化学物质的氧化还原反应来检测电流的变化,从而反映细菌的生长情况[30]。（3）电势生物传感器。主要检测离子选择电极的电荷的积累,该电极的电势可选择性地响应给定离子的浓度[31]。（4）场效应晶体管生物传感器。主要由源极、漏极、栅极组成,连接源极和漏极的半导体材料修饰生物识别分子,当其识别靶标分子后,改变了半导体材料的电导,而栅极施加的栅压可放大输出的电流变化[32]。（5）电导生物传感器。将能够识别、结合靶标分子的介质（如纳米线）连接2个电极,通过监测介质的电导率变化实现对靶标分子的选择性检测[33]。

2.4基于机械学的表型AST

2.4.1异步磁珠旋转传感器 异步磁珠旋转（asynchronous magnetic bead rotation,AMBR）传感器是一项无标签、能够进行实时监测的技术。放置在外部旋转磁场内的磁珠具有一定的旋转频率,而这种频率受到磁珠（即形状和体积）的变化或环境（即黏度）的影响。基于扭矩的磁珠传感器可监测由单个细菌细胞的附着和生长引起的阻力变化。当细菌细胞附着到饰有特异性抗体的磁珠上,磁珠复合物的有效体积会增加,然后在显微镜上对细菌的伸长和分裂进行观察和测量,并量化传感器磁珠的旋转周期的变化。SINN等[34]将单个AMBR生物传感器限制在纳米级大小的油包水（w/o）液滴内,来监测细菌细胞的增长。该系统的高灵敏度使得异质性研究以及单细胞动力学研究成为可能。同一小组利用该技术开发了AMBR黏度计,当细菌生长时,细菌浓度以及分泌的多糖会影响溶液黏度,最终改变珠子的旋转频率[35]。虽然AMBR传感器已经显著减少AST测量时间,但仍需复杂的驱动磁场来确定每个磁珠的旋转周期。CHUNG等[36]开发了一项将光扩散法和基于磁珠的免疫分析相结合的技术来量化粒子的布朗运动。当活细菌特异性附着在颗粒上时,光扩散率会上升；当经过抗生素作用的敏感菌附着在颗粒上时,光扩散率会下降。该方法的灵敏度高,只需少量样品就可同时测定多种病原体。随后,CHUNG等[37]为同时检测多种病原体的药物敏感性优化了该项技术。通过不同的病原体特异性抗体功能化的荧光色颗粒与病原体结合,使用ImageJ将多色粒子图像分开,从而产生每种荧光色的图像集。然后,通过互相关算法分析分割后的图像集,以评估其相应的扩散率值。相对扩散率值是通过将抗原抗体特异性结合的粒子的扩散率除以参考粒子的扩散率而获得的,从而消除了因不同环境因素或背景噪声引起的测量差异。

2.4.2纳米机械生物传感器 纳米机械生物传感器具有微米甚至纳米尺寸的运动部件,通常是悬臂形的。由于生物分子的大小与传感器的尺寸（主要是厚度）相当,因此传感器对吸附的生物分子的机械特性高度敏感。当细胞特异性吸附于悬臂时,质量、表面应力、有效杨氏模量、黏弹性等参数会发生改变,导致传感器发生偏转或共振频率的变化,通过光学、电学技术可以至少以0.1 nm Hz—1/2的灵敏度检测到传感器的机械变化[38]。其中,最常用到的是光杠杆技术,其原理是检测经传感器表面反射的激光束的偏转。STUPAR等[39]通过将纳米机械生物传感器与快速获取血液培养物中的细菌沉淀的方法相结合,可直接对血液样品进行药敏试验,其利用氯化铵离心技术在1 h内对来自阳性血液培养物的细菌进行浓缩,当附着的细菌具有代谢活性时,可通过光学杠杆方法来检测传感器的振荡,并在3 h内检测出大肠杆菌对环丙沙星等药物的敏感性。而电学技术中最常用到的压阻检测,该技术需要将压阻元件与传感器一体化,利用惠斯登电桥测量由分子吸附在压阻元件后引起的电阻变化。NUMFOM等[40]将PCR技术应用于压阻式纳米机械生物传感器,当霍乱弧菌的ctx A基因与压阻材料上的ssDNA探针结合时,可引起压阻材料的电阻变化从而检测传感器的弯曲度。该传感器可在3.25 pg或14 nmol/L的DNA模板中检测出ctx A基因,比传统PCR的灵敏度高10倍。原子力显微镜是连接着微悬臂的显微镜,可以对悬臂表面的细胞进行扫描以获取其形态、生长情况等信息。原子力显微镜有许多优点,首先它具有非常高的分辨率,可以识别细菌的纳米结构；其次,它可用来探索微生物的纳米力学特性,同时探测外部刺激引起的形态和机械变化；另外,AFM还可以任何环境条件下使用,包括液体、真空在内[41]。但是,纳米机械生物传感器仍存在着局限性。例如,悬臂的尺寸会影响捕获细菌的数量；在液体环境中测量共振频率的灵敏度会由于液体阻尼的存在而受到悬臂的低质量（Q-因子）的限制。而微通道谐振器可以很好地解决这一问题。由于液体在悬臂内,后者可在真空环境下发生共振,使得分辨率变得更高。但由于微通道谐振器缺乏检测选择性,ETAYASH等[42]将其和红外光谱结合,在微悬臂中嵌入一个微通道,通过获取包括细菌的吸附质量、表面应力、红外光谱在内的3个信号来提高该检测系统的选择性。首先,细菌的吸附会改变悬臂的质量,导致悬臂共振频率发生变化。然后,吸附引起的表面应力会使悬臂弯曲。另外,由于非辐射衰减,当红外辐射照射悬臂时,被吸附的细菌吸收特定的红外波长,悬臂发生额外的偏转。

2.5其他

2.5.1流式细胞术 种群的异质性以及细胞间的相互作用的存在影响试验的准确性,而流式细胞术可对单细胞进行评估,其正好解决这一问题。流式细胞仪能检测细胞个数和生理特性,包括膜电位、膜完整性、DNA含量、酶活性等,并且每秒能够分析成千上万个细胞[43]。通过选择不同的荧光探针和不同角度的光散射来进行细胞分选,其中光散射反映细胞大小和结构,而荧光则反映DNA或特定蛋白质的含量、酶活性、膜电位[44]。

2.5.2微流体技术 微流体技术可将细胞限制在微米级甚至是纳米级的设备中,因此,可以高度控制细胞的微环境。微流体技术的发展归功于一种易于使用的制造技术,即软光刻技术,它可制造不同形状的弹性体聚合物的微器件,而目前最常用的就是聚二甲基硅氧烷[45]。微流体技术有非常多的优点:可根据试验需求为单细胞制造不同的微生物环境；在物理上实现隔离,但允许化学交流；使目标分子容易达到可检测水平；微流体系统的较大的表面积与体积比有助于细菌的快速生长[46]。由于很多细菌具有很强的运动能力,因此还可以利用微流体将其捕获在液滴,微腔,通道中,进而用直接和间接的方法对单个细菌的生长进行监测[47]。目前,利用微流体技术开发了多种具有特定功能的设备,比如浓度梯度生成器,高通量筛选平台,微腔阵列等。浓度梯度生成器通常是由一系列的通道和腔室组成,层流的液体在通道中随着流动发生扩散混合,最终在腔室形成线性浓度梯度的化学物质。因此将浓度梯度生成器应用于药敏试验,不仅减少了人力,而且能观察细菌对线性浓度梯度的抗生素的反应[48]。为了在短时间内确定细菌在使用抗菌药物后是否能继续分裂,CHOI等[49]开发了一种单细胞形态分析（SCMA）技术,首先将细菌和琼脂糖混合后注入微流体通道内然后通过凝胶固化将细菌固定,接着抗菌药物扩散至琼脂中,并对细菌的形态变化进行延时成像,最终观察到细菌发生分裂、丝状形成、肿胀、丝状形成与分裂、肿胀形成与分裂等5种形态变化。BROUZES等[50]提出一种基于液滴的微流体技术,可将单个细胞和药物封装在不混溶的独立水性微滴（体积为1～104p L）中,为了进行高通量筛选,他们还对每一种药物编码了光学标签,将药物与细胞混合后,经过染色可检测液滴的荧光,进而识别液滴中的药物。他们还利用自己开发的液滴存活力测定法对液滴内细胞活力和生长进行定量评分。这种基于液滴的技术的优点包括:液滴的微小体积使试剂快速有效混合；高通量地对液滴进行数字处理；特别适用于处理可用性有限的细胞,例如干细胞或患者的原代细胞。在细菌生长过程中,糖的代谢产物有机酸的增加会导致培养基p H值发生变化。针对该现象,TANG等[51]开发了一种微流体p H传感器,他们将对p H敏感的壳聚糖水凝胶涂覆在多孔硅芯片上,该芯片用作微流体通道的基底。当p H发生变化时,壳聚糖水凝胶发生溶胀,导致有效光学厚度发生变化,因此可通过傅立叶变换反射光谱法实时观察微通道中p H的变化。该传感器的优点是通过将细菌细胞限制在纳升大小的通道中,可以快速积累代谢产物,还能获得完整的细菌生长曲线。微流体技术在研究一些特殊细菌的试验中也显示良好的发展前景。众所周知,生物膜中的细菌比浮游细菌对抗生素的抵抗力要高得多。而微流体系统不仅能促进生物膜的形成,而且能研究生物膜形成的机制以及抗生素对消除生物膜的影响[52]。

2.5.3等温微量热法 等温微量热法（isothermal microcalorimetry,IMC）是将微生物置于安瓿瓶中,通过测量其生长代谢引起的热量变化来研究抗菌药物对待检菌的影响。该方法的优点主要有以下几方面:第一,每个活细胞平均产生1～3 p W的热量,而等温微量热仪可测量低至1μW的热流,因此只需少量样品就可完成检测；第二,密封的安瓿瓶可提高微生物安全性,减少交叉污染；第三,IMC具有非破坏性的特点,经IMC测量后的未受干扰的样本可进行二次评估；第四,IMC还可以对细菌产生的热流变化进行实时监测,经验证,随时间推移累积的热量与细菌含量的升高相关[53]。众所周知,MIC并不能区分抗生素具有抑菌性还是杀菌性,而IMC不仅能够提供MIC结果,而且还能通过定量测量抗生素对细菌滞后阶段以及生长速率的影响来确定抗生素的性质。具体而言,延长的滞后阶段表明抗生素具有杀菌活性,这是由于即使一部分细胞被杀死,其最大生长速率也不受影响或受到的影响较小；而抑菌剂会干扰细胞过程,导致最大生长速率下降而对滞后期持续时间的影响很小[54]。但是,由于安瓿瓶内的气体无法流通,同时不同细菌和抗生素、初始的细菌浓度等因素导致检测时间的不确定性,使得瓶内的环境存在差异,从而影响试验的准确性。

3 展望

近年来,快速药敏试验技术的发展为控制耐药性带来了希望。但是,许多技术虽然加快了临床病原微生物对药物敏感性的检测速度,但仍要求在检测之前从临床样品中分离纯化出病原微生物。因此,加快药敏试验的整个进程甚至实现直接用临床样本进行药敏试验将成为最终要解决的难题。譬如,血液的成分比尿液的要复杂得多,如何在实现直接对临床血液阳性培养物进行药敏检测的过程中降低其背景值的问题也需要建立标准。在缩短检测时间的同时必须要与传统药敏试验进行对比以验证准确性,美国FDA规定,严重错误率（误鉴定为敏感菌株）必须＜1.5%,主要错误率（误鉴定为耐药菌株）必须＜3.0%。上述新兴药敏试验检测技术虽然缩短了检测时长,但是与“金标准”药敏试验方法相比,仍需要对其成本效益、准确性、实用性做出进一步的评估。