PCV3自然感染仔猪病例的病理学观察及体内分布

吕志凯，张伟超，陈永林，孙秀秀，王 庚，涂 军，钱 平，程国富，陈 品*

(1.华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉 430070；2.广西扬翔股份有限公司，广西 贵港 537100)

2016年，PALINSKI等[1]收集患有皮炎肾病综合征的母猪及流产胎儿的组织病料进行qPCR和IHC检测，结果显示猪圆环病毒2型(PCV2)阴性，通过宏基因组测序及遗传进化树分析，发现了一种未知的圆环病毒，将其命名为猪圆环病毒3型(PCV3)[2]。美国首次报道PCV3后，世界范围内随即也陆续检测并报道发现PCV3的存在,包括韩国、波兰、意大利、巴西、俄罗斯、西班牙和瑞典[3-4]。2016-2017年，我国南方地区尤其是广东省大量猪场的仔猪出现先天性震颤导致站立和行走困难，仔猪死亡率高，徐国等[5]通过对死亡仔猪的组织样本检测，发现PCV3在我国已经存在。PCV3与PCV2引起的临床症状相似，给全球养猪业带来了巨大的经济损失[6-7]。本研究旨在通过揭示PCV3在感染猪组织器官中的分布规律及其对猪体组织产生的病理损伤变化，为后续深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂鼠抗PCV3单克隆抗体由扬州大学预防兽医系高崧教授馈赠；山羊抗鼠源/家兔源二抗抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB显色粉剂购自博士德生物工程有限公司。

1.2 样品来源及收集样品采自广西贵港动物疫病净化示范区内的部分规模化猪场。从剖检的病、死猪中筛选出猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及PCV2五种病原RT-PCR检测阴性且PCV3 RT-PCR检测阳性的16头病、死猪作为研究对象；另挑选PPV、PRV、CSFV、PRRSV、PCV2及PCV3 RT-PCR检测均为阴性的4头健康猪作对照组。每头病猪采集大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肠(十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠)、扁桃体、肾上腺、胰腺及淋巴结(肺门淋巴结、下颌淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟浅淋巴结、腘淋巴结、膝前淋巴结)、皮肤等23个组织的病变部位经4%多聚甲醛固定后常规制作石蜡切片。

1.3 大体病变记录及样品处理检查并详细记录病、死猪的体表特征及各组织器官的质地、颜色和病变情况。

1.4 常规石蜡切片制作及HE染色将固定好的组织进行二次取材，然后将组织放入包埋框中并暂在10%福尔马林溶液中保存。将以上组织放入全自动脱水机中，进行常规酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡，包埋完成后，制成3 μm厚的石蜡切片，然后使用全自动染色机进行HE染色。

1.5 免疫组织化学染色对石蜡切片常规脱蜡至水，经过3%过氧化氢避光阻断、微波修复、正常浓度山羊血清封闭、一抗(工作浓度为1∶800)4℃孵育过夜、二抗(工作浓度为1∶1)室温孵育、DAB避光显色、苏木素衬染、盐酸分化和甘油明胶封片等过程，最后在光学显微镜下观察并制图分析。

2 结果

2.1 PCV3病原学检测结果排除猪场几种主要病毒病的混合感染后，筛选出PCV3单独感染的病、死猪16头，具体检测结果见表1。

表1 PCV3的qPCR检测结果

2.2 临床症状及剖检变化PCV3感染猪初期消化功能降低出现食欲不振到被毛粗乱无光泽(图1A)；大脑外观肿胀变大、脑膜下弥漫性出血；心脏冠状沟胶冻样水肿块附着(图1B)，个别病例心包液内有纤维蛋白索状物；肺脏膨大，心叶、尖叶及膈叶间质增宽、水肿，个别病例可见肺表面岛屿样实变区；肝脏肿大，表面时有大小不等灰白色散在病灶；胃肠不同程度的卡他性胃肠炎，鸡肠样变化；肾脏不同程度的肿大，色彩多样构成花斑状外观(图1C)；肾上腺肿大，坏死灶出现在皮质部；全身淋巴结不同程度肿大，外观呈灰白色或深浅不一的暗红色；脾脏肿大，边缘有丘状突起以及出血性梗死灶；扁桃体表面黏液附着，有针尖状出血点，颜色变暗。

A.PCV3感染猪被毛粗乱；B.PCV3感染猪心脏冠状沟胶冻样水肿；C.PCV3感染猪肾脏点状出血，色泽变淡；D.PCV3感染猪淋巴结肿大，呈灰白色或暗红色

2.3 组织病理学观察心脏：心肌纤维肿胀、纤维间轻微出血，溶解断裂；肝脏：中央静脉及肝窦内淤血严重，肝索排列紊乱(图2A)；脾脏：脾小结和动脉淋巴鞘结构不清晰甚至数量减少，淋巴细胞溶解消失，坏死区出现单个或多个组织细胞团块；肺：间质性肺炎，支气管上皮细胞坏死脱落，散在管腔内，炎性细胞如淋巴细胞、巨噬细胞浸润，大量淋巴细胞及巨噬细胞填充其中(图2B)；肾脏：肾脏皮质部小动脉充血，毛细血管及肾小管间淋巴细胞浸润；扁桃体：淋巴小结萎缩数量减少，生发中心及淋巴帽中淋巴细胞不同程度的变性坏死，淋巴细胞数量减少明显，巨噬细胞出现；食管：黏膜下层淋巴细胞和巨噬细胞浸润，淋巴滤泡增生，偶见中性粒细胞(图2D)；淋巴结：淋巴结副皮质区及淋巴窦增宽，巨噬细胞浸润其间；生发中心淋巴细胞核破碎、坏死，网状细胞及巨噬细胞增多，个别病例淋巴结毛细血管淤血(图2C)；胃：固有层腺体周围毛细血管扩张，充血，淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞浸润；十二指肠、空肠及直肠：固有层增宽，巨噬细胞、中性粒细胞浸润；回肠：Peyer's Patch增生明显，生发中心大量网状细胞成团状代替淋巴细胞，淋巴细胞凝固、破碎，巨噬细胞出现；盲肠、结肠：固有层淋巴滤泡增生，炎性细胞团块样存在，可见少量淋巴细胞，巨噬细胞及中性粒细胞增多、浸润；胰腺：小叶间隙轻微充盈变宽，导管及腺细胞间质内巨噬细胞浸润；肾上腺：血窦内大量淤血，束状带、网状带间隙内血细胞、巨噬细胞及淋巴细胞浸润；脑：脑膜水肿、脱离，脑膜下毛细血管充血、淤血，少量胶质细胞包绕神经细胞周围，毛细血管周围淋巴细胞、巨噬细胞浸润；皮肤真皮层毛细血管淤血，汗腺周围嗜酸粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润。

A.肝脏中央静脉、肝窦淤血，肝细胞颗粒变性，肝窦内出现少量巨噬细胞、淋巴细胞；B.肺毛细血管充血，肺泡上皮细胞脱落，结缔组织增生；C.淋巴结淋巴小结结构模糊，淋巴细胞减少，网状组织填充坏死区；D.食管黏膜下层淋巴滤泡增生，淋巴细胞及巨噬细胞浸润

2.4 PCV3在感染猪组织中的分布PCV3感染猪组织切片免疫组化染色结果显示，PCV3阳性信号出现在淋巴细胞和巨噬细胞的细胞质中，少量阳性信号出现在感染细胞的细胞核中，对照组无阳性信号(图3)。

A.对照组：以PBS代替一抗复染扁桃体组织切片，DAB显色未见阳性信号；B.对照组：以PBS代替一抗复染淋巴结组织切片，DAB显色未见阳性信号；C.扁桃体：PCV3阳性信号位于上皮细胞及淋巴小结内巨噬细胞及单核细胞胞质中；D.淋巴结：PCV3阳性信号出现在淋巴小结及弥散淋巴组织的淋巴细胞及巨噬细胞中

3 讨论

在本试验中，猪感染PCV3后，最初表现消化功能低下，继而食欲不振、被毛粗乱同时伴发呼吸系统症状，随着病程进一步加深，病猪生长停滞，浅表淋巴结肿大，混合其他病原感染后，出现发烧死亡，与研究报道结果一致[1,8]。采用免疫组化方法检测PCV3在猪体内的分布，发现PCV3阳性信号主要出现感染细胞的胞质中，有少量出现在感染细胞的细胞核中，结果与PALINSKI等[1]采用免疫组化检测PCV3的结果相符合。PCV2的主要靶细胞和PCV3一样，主要是淋巴细胞及巨噬细胞，因此感染猪的免疫器官病变明显，扁桃体、淋巴结及脾脏中淋巴小结结构模糊，淋巴细胞减少，生发中心网状细胞、巨噬细胞浸润[9-10]。

本研究发现，PCV3可单独引发病猪表现PMWS症状，镜下也呈现相应的病理特征，且PMWS症状的严重程度与感染猪的年龄、饲养管理及有无其他病原混合感染有关。有研究认为，PCV2不能单独引发PMWS，接种PCV2不能复制出PMWS的症状[11]。KRAKOWKA等[12]将PCV2细胞培养物经口鼻接种未吃初乳的1日龄仔猪，26 d后剖检时发现猪肠系膜淋巴结中度肿大，镜下观察发现淋巴结生发中心网状细胞成团出现。ROVIRA等[13]将PCV2细胞培养物经皮下接种初生未饲喂初乳的仔猪对其引发的病理变化进行观察，结果发现仔猪无任何PMWS症状，显微镜下观察并未发现实质器官发生病变或炎症。

PCV3感染猪各段肠管均有明显的炎症反应，这与唐宁等[14]的研究结果不同，将PCV2接种断奶仔猪，胃及各段肠管均未见病变。PCV3感染猪胰腺及肾上腺可见淋巴及巨噬细胞浸润，PCV2感染猪的胰腺及肾上腺未见病变[14-15]。此外研究结果显示，肺泡上皮细胞及肾小管上皮细胞中均未检测到PCV3阳性信号，与此不同的是PCV2除了感染单核细胞和巨噬细胞还可以感染肺泡上皮细胞及肾小管上皮细胞[16]。