猪圆环病毒三重PCR检测方法的建立及其广西地区流行病学调查

赵 晶，施开创，刘惠心，尹彦文，龙 凤，陆文俊，屈素洁，司红彬*

(1.广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2.广西动物疫病预防控制中心，广西 南宁 530001)

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)是一种无囊膜单链环状DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属成员，是目前已知最小的动物病毒，迄今已发现PCV1、PCV2、PCV3和PCV4四种病毒[1-2]。PCV1于1974年首次在猪肾细胞系(PK-15)培养物中发现，是非致病性病毒[3]，但最近的研究发现PCV1能在55日龄的猪胎儿肺中有效复制并产生病理变化，对猪肺泡巨噬细胞有一定的影响[4]。PCV2最早是在20世纪90年代初从患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪中分离到，可以引起PCV相关疾病(PCVAD)，包括PMWS、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)和母猪繁殖障碍等[5]。PCV3是2016年报道的一种新型PCV，可以引起母猪繁殖障碍、PDNS等[6]。PCV4作为新近发现的一种病毒，其潜在影响尚待验证[2]。当前，PCV2、PCV3在世界各主要养猪国家普遍流行，造成巨大的经济损失。迄今，PCV2、PCV3在我国大多数省份均有报道[7]，部分省份也有报道PCV1在猪群中的存在[2,8]。

当前，PCV1、PCV2、PCV3在世界各国的猪群中普遍存在[9-10]，并且在病猪的临床组织样品中发现PCV2与PCV3存在混合感染现象[11-12]。由于PCV2、PCV3均可以导致母猪繁殖障碍、PDNS、PMWS等，其临床症状和病理变化难以区分，须经实验室病原检测和诊断。迄今，已报道有鉴别检测PCV1+PCV2的多重PCR[13]和多重荧光PCR[14]，PCV2+PCV3的多重PCR[15-16]、多重荧光PCR[17-18]、多重数字PCR[19]，PCV1+PCV2+PCV3的多重PCR[20]，PCV1+PCV2+PCV3+PCV4的多重荧光PCR[21]。但是，迄今鉴别检测PCV1、PCV2、PCV3的多重PCR和多重荧光PCR的报道仍然很少。本研究目的是针对PCV1、PCV2、PCV3设计特异性引物，建立同时检测并区分PCV1、PCV2和PCV3的三重PCR方法，并应用于临床流行病学调查以掌握当前广西省PCV的流行状况，为有效防控该疾病提供技术方法和基础数据。

1 材料与方法

1.1 病毒株与临床样品PCV2疫苗株(SX07株)、猪瘟病毒(CSFV)疫苗株(C株)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗株(TJM-F92株)、伪狂犬病病毒(PRV)疫苗株(Bartha-K61株)、猪口蹄疫病毒(FMDV)O型疫苗株(O/Mya98/XJ/2010株)、猪细小病毒(PPV)疫苗株(N株)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗株(CV777株)、猪传染性胃肠炎(TGEV)疫苗株(H株)、PCV1和PCV3临床阳性样品，均来自于广西动物疫病预防控制中心实验室，保存在-80℃备用。从广西各地采集的来自2018—2020年1 312头猪的病料，每头猪均包括脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、扁桃体和淋巴结等组织样品，-40℃保存备用。

1.2 主要试剂核酸提取试剂盒、Premix Taq、DNA Marker、胶回收试剂盒、pMD18-T载体、DH5α感受态细胞、质粒抽提试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；Solar Red 核酸染料购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 引物设计根据GenBank登录的PCV1、PCV2和PCV3基因组序列，通过多序列比对，选择PCV1 BJ-1株(登录号：FJ475129)、PCV2 HX株(登录号：KC860786)和PCV3 PCV3-US/MO2015株(登录号：KX778720)作为参考序列，针对保守区域设计3对特异性引物(表1)，用于检测PCV1、PCV2和PCV3。

表1 引物信息

1.4 重组质粒标准品的构建以核酸提取试剂盒提取PCV2疫苗毒和PCV1、PCV3阳性样品的总DNA为模板，利用设计的特异性引物扩增目的基因片段。PCR反应体系25 μL：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物(25 μmol/L)0.4 μL，模板2.5 μL，灭菌双蒸水补足25 μL。PCR反应程序：95℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 40 s，共35个循环；72℃ 10 min。经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，通过胶回收试剂盒回收、纯化PCR产物，连接到pMD18-T载体中，转化DH5α感受态细胞，涂板，筛选阳性重组克隆菌，经PCR鉴定后抽提质粒并测序鉴定。

通过分光光度计在260 nm和280 nm处测定D值，计算质粒浓度，并通过如下公式换算成拷贝数：拷贝数/μL=6.02×1023×质粒浓度×10-9/(660×质粒总碱基数)。

1.5 三重PCR反应条件的优化为了获得最佳的反应条件，利用构建的重组质粒标准品，采取排列组合方法，在保持其他条件不变的情况下，通过改变单一反应条件，分别对反应体系的引物终浓度(0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45，0.50，0.55 μmol/L)、退火温度(51 ～60℃)和循环次数(20，25，30，35，40个循环)进行优化，以获得最佳的反应条件。

1.6 敏感性试验将质粒标准品p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3等比例混合后进行10倍倍比稀释，使3种质粒浓度均为1010～100拷贝/μL，作为模板，对所建立的三重PCR进行敏感性试验。

1.7 特异性试验以PCV1、PCV2、PCV3 DNA以及CSFV、PRRSV、PRV、FMDV、PPV、TGEV、PEDV的DNA或cDNA为模板，对所建立的三重PCR进行特异性试验。

1.8 重复性试验选取质粒标准品p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3浓度为1.09×107拷贝/μL的等比例混合物作为模板，对所建立的三重PCR进行重复性试验。进行5次重复试验，每次间隔1周。

1.9 临床样品检测随机选取242份临床样品，同时应用本研究所建立的三重PCR方法与之前报道的荧光定量PCR方法[14,17]，对PCV1、PCV2和PCV3进行检测，并计算两种方法检测结果的符合率。随机选取15个阳性样品的PCR产物，回收并送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序以验证检测结果。

应用本研究所建立的三重PCR方法对2018—2020年采集自广西各地的1 308份病料样品进行检测。通过凝胶电泳判定检测结果，出现预期大小183，544，344 bp条带者判为阳性，未出现目的条带者判为阴性。

1.10 数据统计分析针对不同年度、季节、地区和病种，利用卡方检验计算器V1.70发生数格式和配对资料对检测结果计算卡方进行差异性分析，当P≤0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 重组质粒标准品的构建以提取的PCV1、PCV2和PCV3总DNA为模板，利用特异性引物PCV1-F/R、PCV2-F/R和PCV3-F/R进行扩增，获得与预期大小一致的183，544，344 bp扩增片段。产物经回收、连接、转化，阳性克隆提取质粒，经PCR、测序验证后，重组质粒分别命名为p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3，作为阳性标准品。经紫外分光光度计测定浓度，计算成拷贝数，获得p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3浓度分别为1.09×1010，2.97×1010，2.36×1010拷贝/μL。将3种质粒用双蒸水稀释成1.09×1010拷贝/μL，-20℃保存备用。

2.2 三重PCR反应条件的确定经过一系列优化反应条件后，最终确立三重PCR反应条件如下：反应体系25 μL：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物(25 μmol/L)0.3 μL，模板2.5 μL，灭菌双蒸水补足至25 μL。反应程序：预变性95℃ 5 min；变性94℃ 30 s，复性54.5℃ 30 s，延伸72℃ 40 s，35个循环后；72℃ 10 min。应用所建立的三重PCR，以标准质粒p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3作为模板进行扩增的结果见图1。

M.DL2000 DNA Marker；1.标准质粒p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3混合物;2.p-PCV1;3.p-PCV2;4.p-PCV3;5.ddH2O

2.3 敏感性试验以10倍倍比稀释的p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3三种质粒的混合物作为模板，检测三重PCR敏感性。结果，p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3 的检测下限分别为1.09×103，1.09×101，1.09×102拷贝/μL(初始质粒浓度)，具有良好的敏感性(图2)。

M.DL2000 DNA Marker；1～11.初始质粒浓度为1010～100 拷贝/μL;12.ddH2O

2.4 特异性试验应用所建立的三重PCR方法对包括PCV1、PCV2、PCV3以及养猪场常见的重要病毒进行检测以验证其特异性。结果显示，该方法只能扩增出PCV1、PCV2和PCV3目的片段，而CSFV、PRRSV、PRV、FMDV、PPV、TGEV、PEDV和ddH2O则未能扩增出条带(图3)，表明所建立的三重PCR方法具有良好的特异性。

M.DL2000 DNA Marker；1.标准质粒p-PCV1、p-PCV2 和p-PCV3混合物；2.PCV1；3.PCV2；4.PCV3；5.CSFV；6.PRRSV；7.PRV；8.FMDV；9.PPV；10.TGEV；11.PEDV；12.ddH2O

2.5 重复性试验以浓度均为1.09×107拷贝/μL的p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3三种质粒混合物为模板，验证所建立三重PCR方法的重复性。结果显示，5次反应均能扩增出均匀一致的目的条带，表明该方法具有良好的重复性(图4)。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.标准质粒p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3 混合物；6.ddH2O

2.6 临床样品检测

2.6.1符合率的比较 随机选取242份组织病料，同时应用所建立的三重PCR方法与文献报道的荧光定量PCR检测方法[14,17]进行检测。结果显示，PCV1、PCV2、PCV3的阳性率分别为4.55%(11/242)，64.46%(156/242)，7.02%(17/242)，PCV1+PCV2、PCV1+PCV3、PCV2+PCV3混合感染阳性率分别3.31%(8/242)，0.83%(2/242)，6.20%(15/242)，两种方法检测结果的符合率分别为98.70%，95.51%，97.83%(表2)。随机抽取15份阳性样品的扩增产物进行回收和测序，证实为PCV1、PCV2和PCV3的目的片段。

表2 242份临床样品检测结果 %

2.6.22018—2020年广西各地临床样品检测结果 应用所建立的三重PCR方法，检测2018—2020年采集自广西各地的1 308份组织病料。结果由表3可见，2018—2020年，PCV1、PCV2和PCV3的阳性率分别为2.14%，56.65%，5.58%，病毒间阳性率差异显著(P≤0.05)；其间，PCV1阳性率分别为2.45%，2.51%，0.00%，2020年显著下降(P≤0.05)；PCV2阳性率分别为67.00%，50.00%,32.39%，逐年显著下降(P≤0.05)；PCV3阳性率分别5.76%，5.02%,6.25%，各年间差异不显著(P>0.05)。

表3 1 308份临床样品检测结果 %

2.6.3病原时间分布 将2018—2020年1 308份临床样品的检测结果按季度汇总后进行统计分析。结果由表4可见，PCV1在第一、三、四季度阳性率差异不显著(P>0.05)，第二季度阳性率显著下降(P≤0.05)；PCV2在第一、二季度阳性率比第三、四季度阳性率显著下降(P≤0.05)，而在第一、二季度之间和第三、四季度之间阳性率差异不显著(P>0.05)；PCV3在第一、四季度阳性率显著低于第三季度阳性率(P≤0.05)，而第一、二、四季度之间阳性率差异不显著(P>0.05)。

表4 1 308份临床样品检测结果季度统计表 %

2.6.4病原地区分布 将2018—2020年1 308份临床样品的检测结果按地区汇总后进行统计分析。结果由表5可见，PCV1在河池市阳性率最高(4.00%)，在南宁市、钦州市和玉林市未能检出(0.00%)；PCV2在北海市阳性率最高(79.80%)，在钦州市阳性率最低(22.22%)；PCV3在钦州市阳性率最高(8.33%)，在北海市阳性率最低(1.66%)。PCV1、PCV2、PCV3的阳性率在部分地区之间差异显著(P≤0.05)。

表5 1 308份临床样品检测结果地区统计表 %

2.6.5混合感染情况 将2018—2020年1 308份临床样品的混合感染情况进行统计分析。结果由表6可见，混合感染率达到5.58%，其中，PCV2+PCV3(3.52%)、PCV1+PCV2(1.83%)以及PCV1+PCV3(0.15%)和PCV1+PCV2+PCV3(0.08%)之间的混合感染率差异显著(P≤0.05)。

表6 1 308份临床样品检测结果混合感染统计表

3 讨论

由于PCV2、PCV3在世界各国猪群的普遍流行，其所致猪的多种疾病，给养猪业造成巨大的损失，而PCV2与PCV3的混合感染更加重了这些疫病的复杂性和危害性[11-12]。由于PCV2和PCV3所致临床症状和病理变化具有相似性，临床上难以区分，加上PCV1在猪群中的普遍存在对养猪业具有的潜在危害[4]，需要对3种病毒加以鉴别检测，以准确诊断该疫病。为此，本研究试图建立鉴别检测PCV1、PCV2和PCV3的三重PCR方法。

在建立三重PCR过程中，引物是影响三重PCR扩增效率和特异性最重要的因素[22]。为此，本研究先对大量PCV1、PCV2、PCV3毒株的基因序列进行比对，选取病毒基因组的高度保守区域，设计针对不同保守区域的3对特异性引物，且扩增PCV1(183 bp)、PCV2(544 bp)、PCV3(344 bp)的片段大小差异在100 bp以上，以便于琼脂糖凝胶电泳判定时区分条带。另外，需要考虑优化反应的最佳条件[23]。本研究应用的商品化Premix Taq PCR反应预混液，已包括反应所需的PCR缓冲液、Taq聚合酶、dNTP和Mg2+，并且是经过优化的最适比例，因此只需对引物浓度、退火温度和反应循环数进行优化。最终，确定3对引物的最佳终浓度均为0.3 μmol/L，最佳退火温度为54.5℃，最佳循环数为35个循环，并且PCV1、PCV2、PCV3最低检出下限分别达到1.09×103，1.09×101，1.09×102拷贝/μL(初始质粒浓度)，成功建立了鉴别检测PCV1、PCV2和PCV3的三重PCR方法，实现了在一个反应体系中同时扩增3个目的片段、鉴别3种病毒的目标。

应用所建立的PCV1、PCV2和PCV3三重PCR方法，对2018—2020年采集自广西各地的1 308 份病料样品进行检测，结果PCV1、PCV2和PCV3阳性率分别为2.14%，56.65%，5.58%，表明PCV在广西猪群中广泛流行，尤其是PCV2的感染率高达56.65%。LIU等[7]统计涉及我国PCV2流行情况的53篇报道，2015—2019年21个省平均阳性率46.0%(14 230/29 051)，其中上海最低(4.7%)、新疆最高(86.3%)；XIA等[24]报道，2015—2018年从我国10个省采集的样品，PCV2平均阳性率为50%；这些结果表明，PCV2在我国猪群流行极为严重。由于PCV2感染可以抑制机体的免疫功能[25]，除了PCV2相关疫病的损失外，还会降低其他疫病的疫苗免疫效果[26-27]，导致混合感染、继发感染其他疫病，造成更大的经济损失[11-12]，应加强PCV2的疫苗免疫和综合防控措施，减少PCV2所致的各种危害和损失。值得注意的是，PCV3作为2016年才发现的新病原，QI等[28]报道2015—2017年我国21个省174个猪场中猪场水平的阳性率为24.1%(42/174)、样品水平的阳性率为12.2%，HA等[29]报道2016—2019年我国10个省271个猪场中猪场水平的阳性率达到74.2%(201/271)、样品水平的阳性率高达29.3%(1 200/4 094)，对养猪业的危害日益显现。本研究发现2018—2020年PCV3在广西病料样品的平均阳性率达5.58%，略低于其他省份，但PCV3的危害仍然不可轻视。至于PCV1、PCV2、PCV3的混合感染，国内外均有报道[10,20]，而本研究发现2018—2020年广西各地PCV1+PCV2、PCV1+PCV3和PCV2+PCV3混合感染的阳性率分别为1.83%，0.15%，3.51%，其危害有待进一步评估。

对PCV1、PCV2、PCV3的时间、空间分布进行分析发现，首先，PCV1、PCV2的阳性率逐年下降，PCV3则稳定控制。尤其是PCV2在2018—2020年间阳性率显著下降(P≤0.05)，这可能与2018年非洲猪瘟在我国暴发后，散户比例明显下降，而各规模猪场高度重视动物疫病的综合防控，大力加强生物安全体系构建与运行管理，猪场的整体卫生条件和健康水平大大提高有关。其次，不同季节PCV1、PCV2、PCV3的阳性率也有差异，第三、四季度的病原阳性率显著提高，可能与广西秋冬季节天气持续阴冷、潮湿，致使猪群应激较大，且此季节猪群饲养量较大、猪群密度大有关。再次，PCV1、PCV2、PCV3的阳性率在不同地市之间也有差异，可能与各地区养猪业规模化程度、管理水平有关。值得注意的是，PCV2阳性率逐年下降，对提高猪群整体健康和免疫水平极为重要，可以提高猪群的疫苗免疫效果和降低猪群感染其他疫病的几率。最后，PCV3在2016年被发现以来，许多国家均有报道[9-10]，国内多数省份已有报道[7]。本研究中，广西各地PCV3在2018—2020年的阳性率分别为5.76%，5.02% 和6.25%，处于稳定控制状态，低于上述报道的国内其他省份阳性率[28-29]，但仍需持续关注并做好各项综合防控措施。

综上所述，本研究建立了一种快速、特异、灵敏、便利的PCV1、PCV2和PCV3三重PCR方法，可用于鉴别检测3种PCV，为临床样品的检测和流行病学调查提供了有效的技术方法。流行病学调查结果表明，PCV2、PCV3在广西各地猪群广泛流行，应该加强PCV2的疫苗免疫和猪圆环病毒病的综合防控，减少PCV对我国养猪业的危害和损失。