野生鸟类新城疫病毒分离株的生物学特性和系统发育分析

杨少华，黄庆华，崔 宁，孙守礼，许传田

(山东省农业科学院 畜牧兽医研究所 山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东 济南 250100)

新城病病毒(Newcastle disease virus，NDV) 又称为禽副黏病毒Ⅰ型(avian paramyxovirus serotype 1，APMV-1),在分类上属于单链负股RNA病毒目(Mononegavirales)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)禽腮腺炎病毒属[1]。NDV是家禽尤其是鸡传染性最强的疾病之一，能感染家禽和野生鸟类。NDV 基因组约15.2 kb，编码6种主要结构蛋白(3′-NP-P-M-F-HN-L-5′)和2种非结构蛋白(V和W)[2]。血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和融合蛋白(F)是2种在NDV致病性和抗原性中起作用的表面蛋白[3-4]。F 蛋白也被广泛用于NDV的系统发育分类[5-8]，NDV可分为2类，包括Ⅰ类(ClassⅠ)1个基因型和Ⅱ类(ClassⅡ)18个基因型[9-12]。根据NDV对鸡的致病性，可分为高致病性、中致病性和低致病性[13-15]。F 蛋白裂解位点的氨基酸序列是NDV毒力的主要分子决定因子[16-17]。生物学检测如NDV感染后鸡胚的平均死亡时间(MDT)和1日龄鸡的脑内致病性指数(ICPI)与NDV对鸡的致病性有关[14,16]。野生水禽被认为是NDV 的天然储存库，一般携带的毒株为弱毒株，对家禽无致病性，但有研究表明家禽暴发ND与持续存在于野鸟体内的NDV有关[18]。本研究旨在对分离自野鸟的9株NDV分离株的生物性、抗原性、致病性进行了研究，为我国新城疫流行病学、病毒进化的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品与鸡胚从山东东营黄河口湿地采集该区域健康野鸟泄殖腔拭子352份，9～11日龄SPF鸡胚购自山东省农业科学院家禽研究所SPF场。

1.2 主要试剂反转录酶(M-MLV)、Taq酶、RNA酶抑制剂、TRIzol和胶回收试剂盒购自大连宝生物公司。

1.3 病毒的分离与鉴定按照《新城疫诊断技术》(GB16550-2008)中的方法，将棉拭子样品经处理后接种9～11日龄SPF鸡胚，37℃孵育4 d，弃掉24 h死亡鸡胚，测血凝(HA)和血凝抑制(HI)效价，阳性尿囊液-80℃保存备用。

1.4 致病指数检测对分离株进行了MDT和ICPI测定，试验流程按照OIE 标准进行。

1.5 RNA提取和RT-PCR扩增TRIzol法提取病毒RNA，然后立即反转录成cDNA，用于PCR扩增，PCR扩增所用引物为：P1： 5′-CACCAAGCTGGAGAAAGGGCATAC-3′，P2：5′-CAGTATGTT-TGCAGCATTCTGGTTGG-3′。PCR反应条件：95℃ 2 min；94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 30 s，30个循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，阳性样品送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6 遗传进化分析利用分析软件Lasergene和MAGA 5软件对分离株和GenBank中参考毒株F基因变异区(47～420 nt)进行序列比对和系统进化分析，采用邻位相连法(neighbor-joining)构建系统进化树。

2 结果

2.1 病毒的分离鉴定352份棉拭子样品采自健康野鸟泄殖腔，通过接种鸡胚及血凝和血凝抑制试验，共分离NDV 9株，其中分离自燕鸭6株、赤麻鸭2株、大麻鳽1株，NDV分离率为2.56%(9/352)。

2.2 分离株的生物学特性通过致病指数检测发现8个毒株为弱毒株，如分离株CH/JL01、CH/JL02、CH/JL03、CH/JL04、CH/JL07、CH/JL08 其MDT>120 h，ICPI<0.2，分离株CH/JL05和CH/JL09 MDT>96 h，而ICPI分别为0.5和<0.2。值得注意的是分离自健康燕鸭的毒株CH/JL06为中等毒力毒株，其MDT为79 h，ICPI为1.62(表1)，该毒株对家禽的致病性有待进一步研究。

表1 野鸟NDV分离株的特征

2.3 分离株的遗传进化分析利用MEGA 5软件对9个分离株和36个参考株F基因高变区(47～420 nt)系统进化分析表明，9个分离株分属于2个群4个基因型，包括ClassⅠ 2个基因型和ClassⅡ2个基因型(图1)。其中CH/JL01、CH/JL02、CH/JL038和CH/JL04属于ClassⅠ1.1.1基因型，与2010年鸭源分离株NDV 10-062高度同源；CH/JL07、CH/JL08属于1.2基因型，与2008年鸭源分离株NDV08-046同源性最高。CH/JL05、CH/JL06 属于基因Ⅱ型，与疫苗株 LaSota 基因高度同源。CH/JL09属于基因Ⅰ型，与2010年鸭源分离株guangxi20同源性最高，与疫苗株V4的核苷酸同源性次之(图1)。

图1 9株野鸟源NDV分离株F基因可变区(47～420 nt)系统进化分析

2.4 F蛋白裂解位点及其毒力9个NDV分离株F蛋白裂解位点氨基酸基序及其生物学特性见表1。CH/JL01、CH/JL02、CH/JL038、CH/JL04、CH/JL07、CH/JL08 等6个分离株F蛋白裂解位点氨基酸序列为112E-R-Q-E-R-L117，具有典型低毒力NDV的分子特征。分离株CH/JL05、CH/JL06 和CH/JL09的基序为112G-R-Q-G-R-L117，与疫苗株LaSota的基序相同，为低毒力株。然而MD和ICPI试验表明分离株CH/JL06/为中等毒力毒株，这与系统发育分析结果不一致，表明F蛋白的裂解位点基序并不是决定NDV毒力的唯一因素。

3 讨论

NDV可分为2大类，包括Ⅰ类1个基因型和Ⅱ类18个基因型[9-12]，Ⅰ类NDV在活禽市场和野鸟中分离较多，多为不致病的弱毒株[14,18-20]，国内外对其分子流行病学研究报道较少。已有的监测数据显示我国目前Ⅰ类NDV主要分布于我国华东、华中、华南和西南等东部和南部地区[19]。山东东营黄河口湿地位于东亚—澳大利亚西亚候鸟迁徙线路上，是鸟类南北迁徙的重要中转站和越冬栖息地。本研究从山东东营黄河口湿地健康野鸟的352份棉拭子样品中分离了9株NDV病毒，分离率为2.56%(9/352)，其中Ⅰ类NDV 6株，表明Ⅰ类NDV在野鸟中的污染面广分离率高，与研究报道结果相符[19-20]。Ⅰ类NDV1.1.2基因型是目前野鸟源NDV的优势基因型[20]，本试验分离的NDV中有4个毒株属于1.1.1基因型，与2010年鸭源分离株NDV 10-062高度同源；2株属于1.2基因型，与2008年分离于家鸭的毒株NDV08-046同源性最高[21]，一方面说明这2个基因型NDV在山东东营地区野鸟中占比较高，另一方面也说明病毒传播可能发生在禽类和野生鸟类之间。由于这2个宿主间常发生NDV毒株的持续交换[22]，因此养殖场需要排除野生鸟类对家禽的干扰。

本试验分离了2株NDV CH/JL05和CH/JL06与疫苗毒LaSota高度同源，同属于基因Ⅱ型，其F蛋白裂解位点氨基酸基序为112G-R-Q-G-R-L117，符合低毒力NDV分子特征。MDT和ICPI致病性试验发现毒株CH/JL05的生物学试验结果与分子特征相符，为低毒力株，而另一分离株CH/JL06 MDT和ICPI分别为79 h和1.62，是中等毒力的毒株，这与系统发育分析结果及F蛋白裂解位点处的分子特征不符，表明F蛋白裂解位点基序不是决定NDV毒力的唯一因素，感染宿主的不同可能也是NDV毒力和致病力存在极大差异的因素。推测毒株CH/JL06可能来源于家禽疫苗毒，在野鸟体内其毒力逐渐变强，尽管不清楚其在自然界中毒力变强的机制，但在实验室中已经被证实低毒力株可在气囊传代中变为强毒株[23]。野鸟是NDV的天然储库，其携带的NDV基因谱广泛，有的毒株甚至有返强风险，对家禽养殖构成巨大的潜在威胁。尽管我国实施了严格的 ND疫苗接种计划，使得ND的发生由大流行转变为散发性疾病，但来自宿主的选择性免疫压力可以促进NDV的进化，在接种LaSota弱毒疫苗的家禽中也不断发生ND疫情[8]，因此有必要进一步加强野鸟的NDV监控和流行病学调查。