BVDV Erns抗体ELISA检测方法的建立及初步应用

刘勃兴，刘 畅，王利丽，付 祥，吴同垒，刘 洁，高荣菊，张志强*，史秋梅*

(1.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066004；2.河北省唐山市乐亭县农业农村局，河北 唐山 063600)

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)属于黄病毒科瘟病毒属单股RNA囊膜病毒[1-3]。我国BVDV最早发现于1980年[4]，给我国肉牛和奶牛养殖业造成了严重的经济损失。DIAO等[5]对1987—2019年国内牛群中的BVDV进行了Meta分析，发现我国牛群BVDV的感染率约为36.0%，其中，新疆地区BVDV感染率(67.5%)最高，西北地区样品中BVDV抗原阳性率最高。BVDV感染牛临床可出现消化道、呼吸道、生长繁殖异常等症状，病情严重时可导致病牛死亡，还可以造成无任何示病症状但危害更大的持续感染(persistently infected，PI)，据估计，70%～90%的BVDV感染病例无临床表现[6-8]。

BVDV的检测方法大致可分为病原学检测和血清学检测两类，其中BVDV抗体血清学检测可辅助抗原检测，有助于牛群中PI鉴定和评估接种疫苗牛群的免疫接种效果。目前BVDV的血清学检测方法有ELISA、抗体中和试验和琼脂扩散试验等，其中ELISA是世界动物卫生组织推荐的BVDV检测方法之一，也是在实验室诊断中的常用方法。我国BVDV抗体ELISA商品化检测试剂盒的品牌和种类较少，导致BVDV抗体检测成本较高。国内对BVDV抗体ELISA检测方法已开展了大量的研究，其中基于BVDV结构蛋白E2[9-14]、Erns(E0)[9,15-17]这两种囊膜蛋白和非结构蛋白NS3[9,17]蛋白建立的间接ELISA方法居多，此外，抗BVDV纳米抗体双抗夹心ELISA[18]、PPA-ELISA[19]、Dot-ELISA[20]等ELISA类型也应用于BVDV的抗体检测。

为了解河北地区牛群BVDV抗体阳性率，本研究构建了BVDV HB-1株的Erns蛋白(gp48基因)的原核表达载体，并经原核系统表达了Erns蛋白，以该蛋白为包被抗原建立BVDV抗体间接ELISA检测方法，并应用该方法检测河北地区牛血清样品的BVDV抗体阳性率。

1 材料与方法

1.1 病毒株、质粒和血清BVDV HB-1株，分离自河北肉犊牛腹泻样品，由本研究室保存；pET-28a质粒、BVDV阳性血清和阴性血清、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)阳性血清、牛布鲁菌阳性血清、牛轮状病毒(BRV)阳性血清、牛冠状病毒(BCoV)阳性血清、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清均由河北省预防重点实验室提供。

1.2 引物的设计与合成根据BVDV HB-1株的Erns蛋白基因(gp48)序列，应用Primer Premier 5.0软件设计用于Erns蛋白基因(gp48)扩增的引物。E-BamHⅠ：5′-CGGGATCCGAGAACATAACGCA-ATGGAACTTGC-3′；E-SalⅠ：5′-GCGTCGACTGCATATGCCCCAAACCATGTC-3′。

1.3 主要试剂病毒RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱科技有限公司；SalⅠ、BamHⅠ限制性内切酶购自NEB公司；明胶、牛血清白蛋白 BSA-V、IPTG、羊抗小鼠IgG-HRP购自北京索莱宝科技有限公司；SDS-PAGE Gel Kit、eECL Western blot Kit、His-Taggde Protein Purification Kit购自北京康为世纪(CWBIO)生物科技有限公司；兔抗牛IgG/HRP血清、鼠抗His tag antibody购自北京博奥森生物技术有限公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini KitⅠ购自美国OMEGA公司；BVDV ELISA抗体检测试剂盒购自爱德士(IDEXX)瑞士生物科技有限公司

1.4 Erns(gp48)基因的PCR扩增、序列分析及原核表达载体构建与鉴定用病毒RNA快速提取试剂盒提取感染BVDV HB-1的MDBK细胞培养物中的病毒RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，用合成gp48扩增引物进行PCR并回收纯化。将目的基因克隆至pMD19-T载体，构建重组质粒pMD19-T-gp48，转化至DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB培养基上培养，挑取单菌落用gp48基因扩增引物进行PCR检测，阳性菌落送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。从NCBI下载BVDV参考株的Erns基因序列并用Lasergene.v7.1中Editseq软件翻译为氨基酸序列，用Megalign软件进行同源性比对并建立发育进化树。在确认获得的gp48序列无移码突变后，将pET-28a和pMD19-T-gp48质粒经BamHⅠ和SalⅠ双酶切，回收目的片段构建pET-28a-gp48重组载体，转化至BL21感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB培养基，挑取单菌落进行双酶切与测序鉴定。

1.5 重组Erns蛋白的原核表达、纯化及Western blot鉴定将pET-28a-gp48/BL21接种于含卡那霉素的LB液体培养基在37℃恒温摇床培养至D600 nm值为0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃诱导6 h，离心收集菌液，用PBS重悬菌泥超声破碎，收集上清和沉淀，用SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达形式并用His-Taggde Protein Purification Kit纯化蛋白。以鼠抗His tag antibody(1∶1 000)为一抗，羊抗小鼠IgG-HRP血清(1∶5 000)为二抗，Western blot鉴定重组蛋白。

1.6 BVDV抗体间接ELISA检测方法的建立及优化采用方阵滴定法确定。蛋白包被质量浓度分别为每孔包被20，40，80，160，320 ng，血清按照1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400进行稀释。基于上述的最佳条件，分别进行包被条件(37℃包被0.5，1.0，1.5，2.0 h，4℃包被过夜)、封闭液(5%脱脂奶、2% BSA和1%明胶)、封闭时间(37℃封闭0.5，1.0，1.5，2.0 h)、血清孵育时间(37℃孵育0.5，1.0，1.5，2.0 h)、二抗稀释度(1∶5 000，1∶10 000，1∶20 000，1∶40 000，1∶80 000)、二抗孵育时间(37℃孵育0.5，1.0，1.5，2.0 h)和显色时间(37℃显色5，10，15，20 min)的条件优化。

1.10 重复性试验分别验证建立的ELISA方法的批内和批间重复性。批内重复性试验：分别用同批次的重组Erns蛋白包被并封闭后的ELISA板检测4份BVDV阳性和4份BVDV阴性的牛血清；批间重复性试验：分别用重组Erns蛋白包被并封闭后1，14，28 d的ELISA板检测BVDV阳性和BVDV阴性的牛血清。每个血清做3个平行孔，测定D450 nm值，计算不同批次内的变异系数(CV)，评估本研究建立的ELISA方法的批间重复效果。

1.11 与商品化试剂盒比较试验以建立的间接ELISA方法和IDEXX BVDV的ELISA抗体检测试剂盒同时检测河北某牛场的90份牛血清，比较2种方法检测结果并计算符合率，计算方法见表1。

表1 符合率计算方法

1.12 临床样品的检测用本研究建立的间接ELISA方法检测河北地区牛场的血清样品477份，统计并分析牛血清样品的阳性率。

2 结果

2.1 Erns(gp48)基因的PCR扩增、序列分析及原核表达载体构建与鉴定以提取的BVDV HB-1株感染细胞的RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增gp48基因。结果显示，在681 bp出现目的条带，与预期结果一致(图1A)。序列测定与比对分析结果显示，BVDV HB-1株与NCBI数据库国内的BVDV-1型参考株的Erns氨基酸序列同源率为96.0%～99.1%，与国外BVDV-1型的Erns氨基酸序列同源率为92.4%～95.6%，与国内外BVDV-2型的参考株Erns氨基酸序列同源率为79.1%～81.3%。进化树分析结果显示，BVDV HB-1株Erns氨基酸序列与国内的BVDV-1型的Erns氨基酸序列属于同一个大分支，且与相应参考株距离较近，其次距离较近的BVDV株为国外的BVDV-1型参考株，而国内外3株BVDV-2型的参考株处于另一个大分支且距离最远(图2)。序列分析结果表明，BVDV HB-1株Erns氨基酸序列与国内基因1型BVDV的同源性较高，具有作为诊断试剂研发实验材料的潜力。

M1.DL2000 DNA Marker;M2.DL5000 DNA Marker ;1.gp48 基因;2.阴性对照；3.pET-28a-gp48经 BamHⅠ/SalⅠ酶切产物;4.pET-28a

红色代表本研究BVDV毒株；蓝色代表国外BVDV毒株

构建的重组质粒pET-28a-gp48经BamHⅠ和SalⅠ双酶切，得到约681 bp的基因片段和约5 300 bp的质粒片段，与预期结果一致(图1B)。测序结果显示，基因序列无移码、突变，表明成功构建重组质粒pET-28a-gp48。

2.2 重组Erns蛋白的原核表达、纯化及Western blot鉴定将pET-28a-gp48重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导后用SDS-PAGE鉴定。结果显示，在约33 kDa处有目的蛋白条带，与预期蛋白大小一致，重组Erns蛋白以包涵体形式表达(图3A)。用His-Taggde Protein Purification Kit纯化蛋白，结果显示，纯化后仅在33 kDa出现目的条带，无杂带(图3B)。Western blot鉴定结果显示，在33 kDa处出现目的条带(图3C),表明成功获得重组Erns蛋白，且试剂盒纯化蛋白效果较好。

M.蛋白Marker;1.经IPTG诱导后菌体裂解物;2.菌体裂解物上清;3.菌体裂解物沉淀;4.阴性对照;5.纯化前的Erns 蛋白;6.纯化后的Erns 蛋白；7.阴性对照;8.重组 Erns

2.3 BVDV抗体间接ELISA检测方法的建立及优化以重组的Erns蛋白作为包被抗原建立的BVDV抗体间接ELISA检测方法经条件优化试验，最终确定的Erns蛋白包被、封闭、血清、二抗(兔抗牛IgG/HRP血清)及显色条件见表2。

表2 BVDV抗体间接ELISA检测方法反应条件优化结果

2.4 临界值的确定用优化后的间接ELISA方法检测临床30份BVDV阴性血清，结果显示，30份阴性血清D450 nm呈正态分布，经计算临界值为0.326，即待检血清D450 nm高于0.326判定为阳性，D450 nm低于0.326判定为阴性(图4)。

图4 30份阴性血清D450 nm的正态分布图

2.5 特异性试验特异性试验结果显示，除BVDV阳性血清样品(D450 nm=1.204)检测结果为阳性，其余病原阳性血清检测结果(D450 nm<0.326)均为阴性(图5),表明本研究建立的间接ELISA抗体检测方法具有较强特异性，能特异性检测出BVDV阳性血清。

图5 特异性试验结果

2.6 敏感性试验用建立间接ELISA方法分别检测不同稀释度的BVDV阳性血清。结果显示，经1∶1 600稀释BVDV阳性血清后检测结果仍为阳性(图6)，表明本研究建立的间接ELISA抗体检测方法具有较高的敏感性。

图6 敏感性试验结果

2.7 重复性试验用4份BVDV阳性血清和4份BVDV阴性血清分别进行批内和批间重复性试验。结果显示，8份血清检测数据的批内CV为1.88%～9.61%，批间CV为0.82%～9.36%，重复性试验的CV均低于10%(表3)，表明本研究建立的间接ELISA抗体检测方法具有较好的重复性。

表3 重复性试验结果(n=8) D450 nm

2.8 与商品化试剂盒比较试验分别用建立的间接ELISA方法和IDEXX BVDV 的ELISA抗体检测试剂盒对河北某牛场的90份牛血清进行检测。结果显示,IDEXX试剂盒检出阳性样品72份，阴性样品18份，本研究建立的方法检出阳性样品72份，阴性样品18份。2种方法的总符合率为93.33%，阳性符合率92.00%，阴性符合率71.43%(表4)。结果表明，本研究建立的方法与IDEXX试剂盒符合率较高，具有较高的准确性。

表4 与商品化试剂盒比较结果

2.9 临床样品的检测结果应用建立的间接ELISA方法检测河北地区牛场的血清样品。结果显示，接种BVDV疫苗免疫牛场的牛血清样品BVDV抗体检测阳性率为30.43%～92.86%，而未接种BVDV疫苗免疫牛场的牛血清样品BVDV抗体检测阳性率为0%～100%(表5)，表明建立的BVDV抗体ELISA检测方法能应用于临床样品检测。在接种疫苗免疫的牛场BVDV抗体阳性率明显高于未接种疫苗免疫的牛场，未接种BVDV疫苗免疫的牛场检测出BVDV抗体阳性血清，表明存在BVDV感染。

表5 临床样品检测结果(n=477)

3 讨论

BVDV-1b基因型是全球检出率最高的BVDV基因型，在我国，该基因型也是BVDV主要流行的基因型之一，因此，该基因型常作为疫苗和诊断试剂的试验株。Erns是BVDV的囊膜蛋白之一，在病毒吸附宿主细胞、抑制宿主IFN的产生等方面有着重要的作用[21]。更重要的是，Erns可诱导宿主产生中和抗体，据报道，在PI动物的血清中Erns抗体质量浓度可高达50 μg/L[22]。因此，Erns是BVDV疫苗和诊断试验研制的靶位蛋白之一。本试验BVDV HB-1株分离自河北肉犊牛腹泻样品，基因型为我国主要流行的基因型BVDV-1b，具有作为诊断试剂研发的潜力。进一步对HB-1株的Erns氨基酸序列进行分析，发现BVDV HB-1株的Erns氨基酸序列与NCBI上国内BVDV-1型的参考株同源率为96.0%～99.1%，同源性极高，可作为BVDV抗体ELISA检测方法的包被抗原。因此，本研究构建了pET-28a-gp48，在BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达，成功获得了重组Erns蛋白。

本研究以重组Erns蛋白作为包被抗原建立BVDV抗体间接ELISA检测方法。经条件优化试验，最终确定ELISA反应条件：重组Erns包被质量浓度为40 ng/孔，包被温度和时间为4℃过夜；封闭液为1%明胶溶液，封闭时间为2 h(37℃)；血清稀释倍数为100倍，血清孵育时间为1 h(37℃)；二抗稀释倍数为40 000倍，二抗孵育时间为0.5 h(37℃)；显色时间为10 min(37℃)；临界值为0.326(D450 nm)。进一步对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行验证，结果显示：该方法能特异性识别BVDV阳性血清和阴性血清，而对BRV、IBRV、FMDV、BCoV、牛布鲁菌共计5种在牛常见的细菌和病毒性病原阳性血清检测结果均为阴性，表明该方法具有较好的特异性；当血清经1∶1 600稀释后结果仍为阳性，表明该方法具有较高的灵敏度；批内和批间重复试验的CV均低于10%，表明该方法具有较好的重复性。用IDEXX的BVDV抗体检测试剂盒与本研究中建立的方法同时检测某牛场的血清样品，2种方法的总符合率为93.33%，阳性符合率92.00%，阴性符合率71.43%。在国内同样基于Erns蛋白建立的BVDV抗体ELISA检测方法中，本研究建立的方法敏感性与肖盛中等[15]和丁金花等[16]建立方法的敏感性(1∶1 600)相同，比陈瑞红[9]建立方法的灵敏度(1∶640)高；重复性上，本研究和研究报道[9，15-16]的重复性数据相似，批内和批间CV均小于10%；与其他方法进行符合试验，本研究(93.33%)高于肖盛中等[15](86%)、丁金花等[16](88.67%)、陈瑞红[9](88.1%)建立的方法。但阴性符合率(71.43%)偏低，与阴性样品数量少有关。

应用建立的间接ELISA方法初步对河北地区18个牛场的477份血清样品进行检测。其中，18个牛场中有4个奶牛场，且均接种了BVDV灭活疫苗(占比100%，4/4)，而仅有2家肉牛场接种疫苗(占比11.76%，2/14)。在接种疫苗的牛场中，抗体阳性率为30.43% ～ 92.86%，表明在接种疫苗的牛场中，BVDV抗体阳性率和抗体水平存有不同，部分牛场的抗体阳性率低于50%，需及时补免。BVDV灭活疫苗在我国上市时间较短，应用的范围较小，但奶牛场对该病的预防接种意识明显高于肉牛场。在未接种疫苗的14个肉牛场中，阳性血清占比明显低于接种免疫后的牛场，其中6个肉牛场的阳性血清占比为0%，仅有1个承德肉牛场的阳性血清占比达100%，其余阳性血清占比均低于50%。在未接种BVDV疫苗的牛场中检测到BVDV抗体，表明该场可能存在感染BVDV或PI牛，应结合RT-PCR等检测方法进一步确认这些牛场的肉牛是否存在BVDV感染。