禽腺病毒强毒(FAdV-4)WZ株对SPF鸡和SPF鸭的致病性比较

李利杰，孙文杰，刘 琳，王赛楠，赵振超，张世华，陶明月，高文明，李新生

(河南农业大学 动物医学学院，河南 郑州 450002)

包涵体肝炎-心包积液综合征(hepatitis hydropericardium syndrome，HHS)于1986年在巴基斯坦安卡拉地区首次报道，称为“安卡拉病”；因为心包积液后似荔枝，也称为“荔枝病”[1]。此后，该病在亚洲、南美洲、北美洲和欧洲等多个地区广泛传播。2015年，HHS在我国主要养鸡地区暴发[2]。给我国养禽业造成了巨大的经济损失。HHS主要引起3～6周龄仔鸡急性死亡，病死率为10%～80%，典型病变为：肝脏发生包涵体肝炎、心包内有淡黄色、胶冻样积液[3]。

在我国暴发的HHS是由高毒力禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV)引起的[4]。FAdV属于禽腺病毒科禽腺病毒属病毒，共分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个群[5]。其中Ⅰ群FAdV分为A、B、C、D、E 5个种，FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、FAdV-11共12个血清型[6]。12种血清型的FAdV均可引发禽类的肝炎、心包积液综合征或HHS。在我国鸡群流行感染引起HHS的病原属于Ⅰ群C种血清4型禽腺病毒(FAdV-4)[7]。

鸡是FAdV-4强毒最易感的自然宿主，包括肉鸡、商品蛋鸡和种鸡，在其他宿主中很少引起严重的临床发病和高病死率[8]。PAN等[9]从患有心包积液的病鸭体内分离出1株鸭源FAdV-4毒株，并在SPF鸡和SPF鸭上进行了致病性评价，发现其在鸡中可诱发严重的心包积液和导致10%的病死率，而在试验组鸭中均未观察到临床症状。FAdV-4强毒是否感染鸭并导致鸭发病和死亡还尚未见报道。因此，本试验分别经肌肉注射接种28日龄SPF鸭和28日龄SPF鸡高致病力鸡源FAdV-4毒株WZ株，对强毒攻击后鸡和鸭的临床症状、大体病变、存活率、体质量、组织病理学变化、内脏组织病毒载量以及泄殖腔排毒情况进行系统比较研究。

1 材料与方法

1.1 病毒和LMH细胞FAdV-4强毒WZ株由河南农业大学分离鉴定保存；LMH细胞购自ATCC(ATCC®CRL-2117TM)。

1.2 实验动物SPF种鸡蛋购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；SPF种鸭蛋购自哈尔滨兽医研究所。种蛋均由本实验室按照相关标准孵化、饲养于SPF隔离器内。

1.3 病毒培养无菌条件下，将冻存的FAdV-4 WZ株肝组织剪碎，按质量比1∶4加入无菌PBS，充分研磨，制成20%肝组织匀浆，反复冻融3～5次后4 000×g离心10 min，取上清，加入青链霉素混合液使其终浓度分别为100 U/mL、100 g/L，4℃作用2 h，经0.45 μm和0.22 μm无菌滤器过滤后，取200 μL 20%肝组织上清接种至单层的LMH细胞，37℃感作1 h，弃去上清液，PBS清洗3次，加入一定量含2%胎牛血清的DME/F-12培养基，于37℃，5% CO2培养箱中培养，每24 h观察记录1次细胞病变情况，72 h后收获病毒液，反复冻融3次，离心去除细胞碎片后接种于新的LMH细胞。如此重复，在LMH细胞上连续传至F3代，收获病毒液，-80℃ 保存备用。

1.4 病毒毒价测定取上述F3代细胞病毒液用无血清DME/F-12培养基连续进行10倍倍比稀释(10-1～10-10)。取24 h左右长满单层LMH细胞的96孔细胞培养板，弃去原培养基，各稀释度分别接种8孔，每孔加入100 μL稀释好的病毒液，同时设置细胞对照孔。最后，每孔再加入100 μL含2%胎牛血清的DME/F-12培养基，37℃，5% CO2培养箱中培养。连续观察7 d，逐日记录细胞病变孔数，根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

1.5 FAdV-4 WZ株对SPF鸡和SPF鸭的致病性取28日龄SPF鸡和SPF鸭各20只，分别随机分为攻毒组和对照组，10只/组，攻毒组胸部肌肉注射1 mL 含107.8TCID50的FAdV-4 WZ株F3代病毒液，对照组胸部肌肉注射1 mL PBS，各组均分开饲养，攻毒后连续14 d，每天称体质量、记录发病和死亡情况。死亡鸡只和鸭立即剖检，观察大体病变。

1.6 样品采集攻毒后1～14 d，随机抽取攻毒组和对照组各5只SPF鸡和SPF鸭，分别采集泄殖腔拭子。采集攻毒后病死鸡、鸭和攻毒后14 d未死亡鸡、鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织样品，部分样品于室温下用4%甲醛溶液固定，剩余样品于-80℃保存备用。

1.7 病毒DNA提取和荧光定量PCR将1.6中-80℃ 保存的组织样品用PBS匀浆，4 000×g离心10 min，吸取组织上清；将1.6中采集的泄殖腔拭子分别用1 mL PBS于4℃浸泡1 h，8 000×g离心10 min，吸取上清液。根据说明书方法提取DNA。

参照文献[10]建立的FAdV-4 TaqMan实时荧光定量PCR方法，使用正向引物：5′-TCAGCAGGCCATCCAAC-3′，反向引物：5′-TGTCGAACA-CGCCATAGAG-3′，TaqMan探针：5′-FAM-ACCTGTGGACCATCCCGTTCAGT-TAMRA-3′。反应体系：2×Premix Ex Taq 10 μL，正、反向引物各0.4 μL，探针0.8 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃延伸20 s，共40个循环。测定SPF鸡和SPF鸭心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织样品和泄殖腔拭子中FAdV-4的病毒载量，每个样品一式3份，进行荧光PCR方法鉴定。

1.8 组织病理学观察取1.6中固定的组织样品，进行常规处理，包埋于石蜡中，切成5 μm左右的薄片，经苏木精和伊红(HE)染色后使用光学显微镜观察各组织病理学变化。

2 结果

2.1 F3代FAdV-4 WZ株可致LMH细胞稳定病变F3代FAdV-4 WZ株接种后24 h即可观察到LMH细胞皱缩变圆，折光性增强；接种后48 h可见细胞聚集成团状，似葡萄串，部分细胞崩解死亡(图1)；接种后72 h约95%的细胞脱落崩解。

A.．正常LMH细胞；B．接种后48 h LMH细胞

2.2 病毒毒价测定结果FAdV-4 WZ株经梯度稀释接种于LMH细胞，连续观察7 d，根据Reed-Muench法计算，F3代WZ株的TCID50为10-7.8/0.1 mL。

2.3 SPF鸡接种FAdV-4 WZ株后的临床症状和大体病变攻毒组SPF鸡在攻毒后1 d发病2只，死亡0只；攻毒后2 d全部发病，表现精神沉郁、羽毛蓬松、嗜睡、采食量减少和拉黄绿色稀便，并死亡8只；攻毒后3 d全部发病死亡(图2A)。攻毒后攻毒组体质量明显降低，与对照组SPF鸡相比差异显著(P<0.05)(图2B)。死亡鸡只剖检可见：心包内积有大量的水样或果冻样淡黄色渗出液，肝脏肿胀发黄、出血、易碎，肾脏肿大、出血(图3)。而注射PBS的对照组SPF鸡生长健康良好。

2.4 SPF鸭接种FAdV-4 WZ株后的临床症状和大体病变以同样剂量肌肉接种SPF鸭，攻毒后1～14 d，与注射PBS的10只对照组SPF鸭一样，攻毒组10只鸭精神、采食、粪便均正常，未表现出任何临床异常；体质量与对照组SPF鸭相比差异不显著(P>0.05)；剖检也均未见病变(图2C，D,图4)。

A、B.分别为SPF鸡的存活和体质量曲线；C、D.分别为SPF鸭的存活和体质量曲线 *表示攻毒组与对照组SPF鸡的体质量差异显著(P<0.05)

A.、B．攻毒组SPF鸡的心脏、肝脏和肾脏；C、D．对照组SPF鸡的心脏、肝脏和肾脏

A.、B．攻毒组SPF鸭的心脏、肝脏和肾脏；C、D．对照组SPF鸭的心脏、肝脏和肾脏

2.5 攻毒后SPF鸡和SPF鸭内脏组织病理学分析攻毒组SPF鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胸腺组织切片经HE染色可观察到明显的组织病理学损伤(图5)。心脏内可见心肌细胞周围间质性水肿、细胞间隙增大、中性粒细胞和单核细胞轻度浸润(图5A)；肝实质细胞核内出现嗜碱性包涵体、间质出血、肝细胞核溶解坏死(图5B)；脾脏间质广泛出血、淋巴细胞数量减少(图5C)；肺部严重充血、终末细支气管扩张(图5D)；肾间质大范围充血、肾小管上皮细胞从基底膜脱落坏死、淋巴细胞浸润(图5E)；胸腺内淋巴细胞大量减少、局部坏死(图5F)。

A.心脏，间质性水肿、淋巴细胞浸润(100×)；B.肝脏，出血、核内嗜碱性包涵体(400×)；C.脾脏，淋巴细胞数量减少、广泛出血(100×)；D.肺脏，严重充血(100×)；E.肾脏，间质大范围充血、肾小管上皮细胞从基底膜脱落坏死(100×)；F.胸腺，淋巴细胞大量减少、局部坏死(100×)

在攻毒组SPF鸭的内脏组织中均未观察到明显的组织病理学损伤(图6)。

A.～F.分别为攻毒组SPF鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胸腺组织

2.6 内脏组织病毒载量测定通过建立的TaqMan荧光定量PCR方法，在攻毒组SPF鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、法氏囊、胸腺、气管、腺胃和小肠中均检出FAdV-4。肝脏的病毒载量最高，为4.66×107拷贝/μL，其次为小肠、肾脏、肺脏、脾脏、胸腺、腺胃、气管、法氏囊、心脏，且肝脏与其他组织的病毒载量相比差异极显著(P<0.01)(图7)。

**表示肝脏与其他组织的病毒载量差异极显著(P<0.01)

而在采集的攻毒组SPF鸭内脏组织中均未检出FAdV-4。

2.7 泄殖腔排毒情况通过实时荧光定量PCR方法检测攻毒后1～14 d各组泄殖腔拭子中的病毒载量。攻毒组SPF鸡在攻毒后3 d内均可检测到排毒,且攻毒后2 d排毒量最高，为2.03×104拷贝/μL，对照组鸡均未检出FAdV-4排毒。攻毒3 d后攻毒组SPF鸡全部死亡(图8)。

图8 攻毒组SPF鸡泄殖腔拭子中FAdV-4的病毒载量

攻毒组SPF鸭在攻毒后1～14 d与对照组鸭结果相同，从拭子中均未检出FAdV-4排毒。

3 讨论

HHS是由FAdV-4引起的鸡的一种急性传染病，潜伏期为3～5 d，感染鸡只突然发病，急性死亡且死亡率高，具有异常激进的临床过程[11]。死亡鸡只剖检常见肝脏炎症和严重的心包积液，通常认为感染鸡大多死于心力衰竭[12]。2015年以来HHS在我国大范围暴发，给我国家禽业健康发展造成了巨大威胁。近来，SHEN等[13]报道在鸭、鹅、鸳鸯和鸵鸟中分离鉴定出FAdV-4，并且呈现出与鸡相似的临床症状。CHEN等[14]研究表明从樱桃谷鸭中分离的FAdV-4对25日龄左右的鸭具有高致病性。这些研究提示FAdV-4在不同动物种间存在跨物种传播的可能性。于是，很多养鸭企业开始使用FAdV-4灭活疫苗或亚单位疫苗免疫鸭，以预防鸭感染FAdV-4，从而避免损失。鸡属于动物界脊索动物门鸟纲鸡形目雉科，鸭属于动物界脊索动物门鸟纲雁形目鸭科鸭亚科[15]。鸡和鸭属于不同目，不同科，不同种动物。通常一种动物易感的病原，另一种动物可能并不一定易感，这样可以避免一种病原微生物同时对多种动物造成感染。例如，H5、H7亚型高致病性禽流感病毒，对鸡具有高致病性，可以导致易感鸡的发病率和病死率接近100%，而对鸭和鹅等则致病力较弱，尽管偶可感染，但较少导致发病和死亡[16]。

导致鸡高病死率的FAdV-4强毒是否对鸭也具有同样高的致病性，本研究选取28日龄的SPF鸡和SPF鸭，选择同样的最佳攻毒途径(肌肉注射)及高致死剂量，以评价当前流行的对鸡呈现强毒力的FAdV-4对鸭的致病性和致死率等。结果显示，鸡源FAdV-4强毒WZ株可致攻毒组SPF鸡发生严重的HHS，肝脏肿大，心包内聚积有大量的淡黄色渗出液；攻毒后体质量与对照组鸡相比显著降低(P<0.05)；攻毒后3 d感染鸡只全部死亡。组织病理学观察可见肝细胞核内有嗜碱性包涵体，免疫器官脾脏和胸腺中淋巴细胞数量减少。攻毒后1 d即可在泄殖腔拭子中检测到排毒，攻毒后2 d检测到的排毒量最高，为2.03×104拷贝/μL。在攻毒组SPF鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、法氏囊、胸腺、气管、腺胃和小肠中均可检出FAdV-4，其中，肝脏的病毒载量最高，为4.66×107拷贝/μL，表明FAdV-4可在鸡多种组织中快速入侵和复制，且肝脏是其主要的靶器官，这与YU等[17]的研究报道一致。而同样条件下，攻毒组SPF鸭在14 d的观察期内没有出现临床症状和死亡；体质量持续上升，且与对照组鸭相比差异不显著(P>0.05)；剖检未见病变及组织病理学损伤；在其组织样品和泄殖腔拭子中均未检出FAdV-4。刘吉山等[18]报道鸭源FAdV-4可致30日龄鸡只死亡50%，鸭源FAdV-4可能在鸭体内多为缺乏临床症状的隐性感染，但在鸡体内则可引起严重的HHS和死亡。本研究结果表明，对SPF鸡具有强致病性且致死率高达100%的FAdV-4 WZ株，即使经肌肉注射，鸭也不感染，不发病。

综上所述，当前对我国养鸡业造成严重威胁的FAdV-4强毒株只感染鸡不感染鸭；在鸭群接种来源于鸡的FAdV-4流行毒株的灭活疫苗和亚单位疫苗预防鸭感染FAdV-4，缺乏完整的病原学和血清学等流行病学依据。对鸡呈现强毒力的FAdV-4毒株对鸭无致病性的内在机制，尚需进一步研究。