基于全基因组序列合成的禽副黏病毒Ⅱ型反向遗传操作系统的建立

王国康，李 丽，贾妙妙，冯贺龙，曾 驰，罗青平，温国元*

(1.湖北省农业科学院 畜牧兽医研究所，湖北 武汉 430064；2.农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，湖北 武汉 430064；3.畜禽病原微生物学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064；4.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)

禽副黏病毒广泛存在于各种动物中，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物和鱼类等。基于血红细胞凝集抑制(HI)、神经氨酸酶抑制(NI)和序列分析，禽副黏病毒可分为18种血清型。禽副黏病毒血清Ⅱ型(APMV-2)于1956年首次发现于加利福尼亚州尤卡帕[1]。此后，世界各地便陆续从鸡、火鸡和野鸟体内分离出APMV-2毒株[2]。该病原的致病力较弱，主要引起感染禽类的轻度呼吸道疾病、火鸡产蛋下降等。

APMV-2为单股负链RNA病毒，属副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽副黏病毒属(Avbulavirus)[3]。APMV-2基因组长度符合“6碱基原则”，从3′端到5′端依次编码核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大聚合酶蛋白(L)6个结构蛋白[4]。

在众多APMV血清型中，APMV-1，又称新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对禽类的危害最大。其引发的新城疫(Newcastle disease,ND)具有较高的发病率和病死率，给世界禽类养殖业带来了巨大损失[5-6]。该病的防控以免疫预防为主，常用的疫苗有灭活疫苗和弱毒活疫苗两种[7]。其中低毒力活疫苗以其使用方便和毒副作用小等优点在我国应用最为广泛，为ND的防控起到了关键作用。随着分子生物学的飞速发展，利用反向遗传操作技术，以NDV作为活疫苗载体的新型禽用疫苗研发成为了研究热点[8]。但在家禽养殖过程中，由于ND疫苗免疫频次过高，导致家禽体内普遍存在较高水平的NDV抗体，严重干扰了NDV载体疫苗的免疫效果[9-11]。

研究表明，APMV-2不与NDV抗体存在交叉反应，APMV-2在宿主体内复制受到NDV抗体的影响较小[12]。同时，APMV-2可在鸡胚增殖，能在鸡的气管、肺、大脑、脾脏等部位中稳定复制，其致病力较弱[13-15]。APMV-2有作为禽用疫苗载体的潜力。与研究较为透彻的NDV相比，APMV-2毒株的分离鉴定、致病力及反向遗传操作系统的研究报道很少[8,16]。本研究通过APMV 2型全基因组序列的比对优化和全人工合成，利用反向遗传操作技术，拯救获得了新的APMV-2 Y2株，为该病原的致病机理研究及新型禽用疫苗研发提供了技术平台。

1 材料与方法

1.1 毒株、质粒和菌株pACNR质粒购自北京BioVector NTCC典型培养物保藏中心；痘病毒MAV-T7、仓鼠肾细胞(BHK-21) 、pACNR-T7、pcDNA3.1(+)、pVAX1载体质粒均由本实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；APMV-2多克隆抗体由本实验室制备保存。

1.2 主要试剂与材料2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus)、2×Rapid Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；In-Fusion HD Cloning Kit购自宝日医生物技术(北京)有限公司；DNA Gel Extraction Kit和Plasmid Mini Kit Ⅰ购自OMEGA公司；QIAprep Spin Miniprep Kit购自QIAGEN公司；Hanks液、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、TPCK胰蛋白酶均购自Gibco公司；Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen公司；FITC标记的羊抗鸡IgG购自北京博奥森生物技术有限公司；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.3 APMV-2 Y2株基因组序列的优化对GenBank数据库已公布的12条APMV-2基因序列(登录号分别为：KT071756、KT071757、KT071755、HQ896023、HQ896024、EU338414、HM159993、HM159994、HM159995、LC187305、LC187306、NC_039230)进行同源性分析，综合选择与其余11株序列同源性最高的毒株之一作为参考株。比对参考株核苷酸变异较多的部分，将相应位置的核苷酸序列更改为其他APMV-2的一致序列，获得1株新的APMV-2株(命名为Y2株)的全基因组序列。将优化好的Y2株基因组序列分为9段送至武汉转导生物实验室有限公司进行序列合成。

1.4 引物设计根据Y2株的全基因组序列，设计Overlap PCR引物，用于扩增人工合成的9个小片段，随后将9个小片段融合成AP-H1、AP-H2和AP-H3，同时，每个融合片段的正向引物和反向引物的5′端需要载体两末端同源序列，依次连接至载体。设计扩增Y2株NP、P、L基因的引物，为NP、P、L基因片段加入同源臂、酶切位点和Kozak序列，NP、P、L基因片段的正向引物和反向引物的5′端需要克隆载体两末端同源序列。设计载体线性化引物，用于质粒pACNR-T7、T7-H1、T7-H12和pcDNA3.1(+)的线性化。引物序列见表1。

表1 构建重组质粒所需引物

1.5 全长cDNA克隆及辅助质粒的构建分别以人工合成的重组质粒为模板，利用表1中的Overlap PCR引物，扩增9个小片段AP1-AP9。以AP1、AP2和AP3的PCR回收产物为模板，AP1-F/AP1-R、AP2-F/AP2-R和AP3-F/AP3-R(其中AP1-R、AP2-F/AP2-R和AP3-F稀释至0.1 μmol/L)为引物，经过重叠PCR扩增获得融合片段AP-H1，以同样的方法获得另外两个融合片段AP-H2和AP-H3。以T7-F/T7-R为引物，将载体质粒pACNR-T7线性化，采用In-Fusion克隆的方式，将融合片段AP-H1连接至质粒pACNR-T7，得到重组质粒T7-H1。在T7-H1的基础上，再依次将AP-H2和AP-H3连入，最终获得全长质粒T7-Y2(图1)。

图1 重组质粒T7-Y2的构建示意图

以全长质粒T7-Y2为模板，FZNP-F/ FZNP-R、FZP-F/FZP-R、FZL-F/FZL-R为引物，分别扩增Y2株的NP、P、L基因序列。用引物pcDNA-F/pcDNA-R通过PCR方法，将质粒pcDNA3.1(+)线性化。利用限制性内切酶Hind Ⅲ+EcoR Ⅰ对质粒pVAX1进行双酶切。采用In-Fusion克隆的方式，将NP、P基因序列连接至质粒pVAX1，将L基因序列连接至质粒pcDNA3.1(+)，获得辅助质粒pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L。

1.6 APMV-2 Y2株的拯救采用脂质体转染法，将全长质粒T7-Y2和3个辅助质粒(pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L)，按照4∶2∶1∶1的质量比混匀，加入预先感染痘病毒MAV-T7的BHK-21细胞。37℃孵育6 h后用HBSS洗涤3次，加入细胞培养液(DMEM+2%双抗)。待细胞病变达到80% ～ 90%时，反复冻融3次，离心取上清，以0.22 μm 滤膜除去痘病毒，接种9日龄SPF鸡胚。以红细胞凝集(HA)试验，对拯救病毒进行初步鉴定。

1.7 APMV-2 Y2株的PCR鉴定将HA阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传3代后，收集尿囊液，提取病毒总RNA，反转录成cDNA，以AP5-F/AP5-R为引物，按2 × Rapid Taq Master Mix说明书进行PCR扩增，PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定。

1.8 APMV-2 Y2株的间接免疫荧光检测将BHK-21细胞传至96孔板培养，待细胞密度达到约80%时，接种Y2株病毒尿囊液。感染72 h后弃去培养基，以APMV-2多克隆抗体为一抗，FITC标记的羊抗鸡IgG为二抗进行间接免疫荧光试验，荧光显微镜下观察检测结果。

1.9 APMV-2 Y2株的生物学特性测定APMV-2 Y2株的最低致死剂量的平均致死时间(MDT)、1日龄雏鸡的脑内致病指数(ICPI)、HA和鸡胚半数感染量(EID50)等试验均参照文献[17]方法进行。将APMV-2 Y2株以0.01 MOI接种于铺有BHK-21细胞的96孔板中，在12，24，36，48，60，72，84，96 h 分别收取细胞培养上清，测定每个时间点的病毒TCID50，绘制重组病毒的生长曲线。

2 结果

2.1 APMV-2 Y2株全基因组序列的优化及人工合成比较了GenBank登录的12条APMV-2全基因序列的同源性。如图2所示，登录号为HQ896023、HQ896024、EU338414、 LC187305、LC187306和NC_039230的6个毒株与其余11株序列平均同源性最高，均为86.6%。选取登录号为HQ896023的F8株为参考株，与其他11株序列KT071756、KT071757、KT071755、HQ896024、EU338414、HM159993、HM159994、HM159995、LC187305、LC187306和NC_039230的同源性分别为67.9%，67.9%，67.8%，100%，99.8%，94.4%，87.6%，67.6%，99.8%，99.8%和99.8%。

图2 APMV-2各毒株的同源性分析

通过F8与其余11株的全基因组序列比对分析，将F8株的基因组序列优化如下：第1 440位由T变为多数序列共有的C，第2 142位由C变为多数序列共有的T，第2 709位由T变为多数序列共有的C，第5 552位由C变为多数序列共有的T，第6 397位由A变为多数序列共有的G，第6 868位由A变为多数序列共有的G，第7 768位由G变为多数序列共有的T，第11 753位由A变为多数序列共有的C，第14 409位由G变为多数序列共有的A，第14 480位由T变为多数序列共有的C，末端加上APMV-2其他大部分毒株都具有的序列TTGCTTTGCTATTCCATGTCTGGT(表2)。经武汉转导生物实验室有限公司合成后得到9个含有Y2株基因组片段的重组质粒。

表2 参考株的序列优化

2.2 全长质粒及辅助质粒的构建与鉴定首先采用重叠PCR技术，分别将9个小片段连接为3个大片段AP-H1、AP-H2、AP-H3。然后采用In-Fusion克隆的方式，将3个大片段依次克隆至pACNR-T7载体质粒，得到APMV-2 Y2株的全长cDNA克隆T7-Y2，利用限制性内切酶BamH Ⅰ对重组质粒T7-Y2进行酶切鉴定(图3)，酶切结果与预期相符。利用限制性内切酶Hind Ⅲ对辅助质粒pVAX-NP和pVAX-P进行酶切鉴定(图4)，利用限制性内切酶Sal Ⅰ对pcDNA-L进行酶切鉴定(图5)，酶切结果与预期相符，表明全长质粒及3个辅助质粒构建成功。

M.DL15000 DNA Marker；1.T7-Y2 BamH Ⅰ单酶切产物

M.DL5000 DNA Marker；1，2.pVAX-NP Hind Ⅲ、pVAX-P Hind Ⅲ单酶切产物

M.DL15000 DNA Marker；1.pcDNA-L Sal Ⅰ单酶切产物

2.3 APMV-2 Y2株的拯救与鉴定鉴定成功的重组质粒T7-Y2、pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L共转染至已经感染有MAV-T7的BHK-21细胞，于96 h后收取细胞液，反复冻融3次后接种9日龄SPF鸡胚，96 h后收取鸡胚尿囊液，其HA效价为7～8 log2。将HA阳性的鸡胚尿囊液在9日龄SPF鸡胚连续传代3次，测定其HA效价为8 ～ 9 log2。以引物AP5-F/AP5-R对尿囊液进行PCR扩增(图6)，得到与预期相符的条带，测序结果正确，表明Y2株拯救成功。APMV-2 Y2株感染BHK-21细胞后，进行间接免疫荧光检测，如图7所示，感染有APMV-2 Y2株的BHK-21细胞呈现典型的绿色荧光，阴性对照则未产生荧光。

M.DL2000 DNA Marker；1.PCR鉴定产物；2.阴性对照

A..感染APMV-2 Y2株的BHK-21细胞；B.阴性对照

2.4 APMV-2 Y2株的生物学特性按照OIE标准，对APMV-2 Y2株进行毒力测定，结果显示，Y2株的MDT>168 h，ICPI为0.09，符合弱毒的特征。感染SFP鸡胚后，尿囊液的病毒含量为108.83EID50/mL，HA效价为9 log2。

2.5 APMV-2 Y2株的生长曲线以0.01 MOI接种于铺有BHK-21细胞的96孔板中，收集Y2株感染BHK-21细胞后8个时间点的细胞上清，测定病毒TCID50，绘制Y2株的增殖曲线(图8)，显示Y2株在感染BHK-21细胞60 h时达到最高滴度(103.24TCID50/mL)。

图8 Y2株的细胞生长曲线

3 讨论

ND作为禽类急性烈性传染病之一，现已给禽类养殖业带来了巨大损失[6,18]。为减少ND带来的危害，大部分养殖户对鸡群进行ND疫苗接种10余次，多者甚至20次以上[9]。因此目前鸡体内普遍存在较高水平的ND抗体，对NDV载体的复制带来干扰，严重影响了NDV载体疫苗在鸡体内的复制滴度和免疫原性。有研究表明，APMV-2不与NDV抗体存在交叉反应，APMV-2在体内的复制受到NDV抗体的影响较小[12]。同时，APMV-2与NDV相比，感染后只引发轻度呼吸道疾病、产蛋量下降的症状[19-20]。作为疫苗载体，与NDV相比，APMV-2具有安全性较高、不受ND抗体干扰等特点[19-20]。因此，APMV-2作为禽用疫苗载体具有较好的发展前景。

关于APMV-2的反向遗传系统报道较少[15]。KIM等[21]将APMV-2的F和HN胞外区替换为NDV BC株F和HN胞外区，研究了F和HN蛋白在NDV和APMV-2的复制、组织嗜性和致病性方面的作用，证明了F和HN胞外区共同决定了NDV和APMV-2的细胞融合、组织嗜性和毒力表型。TSUNEKUNI等[12]分别以rAPMV-2、rAPMV-6和rAPMV-10为载体，利用反向遗传技术，构建了表达高致病性禽流感病毒血凝素基因(HPAIV HA)的重组病毒rAPMV-2/HA、rAPMV-6/HA和rAPMV-10/HA，分别免疫7周龄、已预免NDV的雏鸡，免疫后14 d以致死剂量的HPAIV攻毒，结果显示，106EID50免疫组rAPMV-2/HA、rAPMV-6/HA和rAPMV-10/HA的保护率分别为50%，50%和25%，107EID50免疫组rAPMV-2/HA、rAPMV-6/HA和rAPMV-10/HA的保护率分别为50%，50%和90%，而106EID50rNDV/HA免疫后对NDV预免雏鸡保护率为0%，免疫剂量提高至107EID50也只能诱导部分保护。这些结果表明rAPMV-2、rAPMV-6和rAPMV-10作为禽用疫苗载体，特别是对于高频次接种ND疫苗的商品鸡是可行的。

本研究通过对序列比对和设计优化，获得了1株新的APMV-2毒株的全基因组序列，命名为Y2株。人工合成了Y2株的全基因组序列，并构建出了全长质粒T7-Y2和3个辅助质粒pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L。通过病毒拯救，成功获得了重组病毒Y2株，证明了人工合成毒株基因组序列及拯救获得新病毒的可行性，为开展相关研究提供了新的思路，也为APMV-2的致病机理研究及新型禽用疫苗的研发提供了依据。