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犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定及系统进化树分析

时间:2024-05-24

史量全,石 芸,范培超,殷 杰,王永强,郑佳玮,刘 锴,马德慧 (.内蒙古民族大学

动物科技学院,内蒙古 通辽028000;2.内蒙古自治区肉牛疾病防控工程技术研究中心,内蒙古 通辽028000)

大肠杆菌是引起犊牛腹泻的主要病原菌,为革兰阴性菌,在革兰染色下呈红色,菌体染色均匀,显微镜下观察为直杆状,菌体两端钝圆,多散在或成对存在,有些还会产生荚膜[1-2]。大肠杆菌O 抗原,为细胞壁脂多糖最外层的特异性多糖,由重复的多糖单位所组成[3]。目前,已鉴定出的O 抗原总数有196种[4]。通过对大肠杆菌进行血清型分析,可以对未来该病的分群鉴定以及流行病学调查做出贡献。该菌为条件致病菌,广泛存在于自然界中,是导致犊牛腹泻的主要致病菌之一,畜舍卫生条件差是导致新生犊牛感染大肠杆菌的重要原因[5]。本例犊牛腹泻通过实验室一系列诊断方法,最终确定病原为大肠杆菌O132型。

1 材料与方法

1.1 试验病料通辽某肉牛养殖场犊牛剧烈腹泻的新鲜淡黄色粪便,以及该犊牛新鲜血液。

1.2 试验试剂普通液体琼脂培养基(LB)、血液琼脂培养基、2YT 斜面培养基、大肠杆菌全套O 抗原诊断血清188种,购自天津生物芯片技术有限责任公司。

1.3 试验仪器生物安全柜、Thermo Scienific Max Q4450紧凑的台式恒温摇床(美国热点恒温震荡摇床厂家出品);BD PhoenixTM100全自动微生物生化/药敏鉴定仪(广州西马克生物科技有限公司);高速冷冻离心机、梯度PCR 仪(北京德泉兴业商贸有限公司);电泳仪、凝胶成像系统(北京原平皓生物技术有限公司)。

1.4 实验动物体质量20~25 g健康昆明小鼠40只,由内蒙古民族大学动物实验室提供。

1.5 致病菌分离纯化将粪便样品在无菌操作下接种在10%血液琼脂培养基,于厌氧缸内37℃培养16 h。挑取单个菌落接种于LB液体培养基,置恒温摇床37℃、16 h纯培养。取培养物涂片染色镜检。

1.6 致病性试验将已经纯化的菌种在LB培养基中37℃培养12 h,细菌计数,用LB培养基将菌液稀释至1.0×109/m L,菌液腹腔注射5 只小鼠0.5 m L/只;另选5只注射0.5 m L 生理盐水作为对照组,每隔4 h观察一次小鼠情况并记录。

1.7 致病菌的菌落生长特性将该致病菌分别平板划线到血液琼脂培养基和麦康凯培养基,37℃厌氧培养12 h,观察菌落生长情况。

1.8 生化试验及药物敏感性试验将培养的致病菌接入ID 肉汤鉴定培养管调成0.6麦氏单位的菌悬液,吸取30μL菌悬液到药敏肉汤鉴定培养管中,并滴加指示剂。将制备好的菌悬液倒入革兰阴性菌鉴定板对应的鉴定孔中,封闭。检测板准备完毕后,扫描板条,输入资料,将检测板放入仪器中反应。

1.9 分离致病菌的O 抗原鉴定将分离的致病菌接种2YT 斜面固体琼脂培养基,37℃恒温培养过夜;用生理盐水将菌落洗脱下来分装于1.5 m L细胞冻存管中,121℃高压30 min 后鉴定所需的抗原,4℃备用。将待测抗原与大肠杆菌全套O 抗原诊断血清依次等量混合,记录结果。

1.10 16S r RNA PCR 鉴定取纯培养菌液根据DNA 提取试剂盒说明书,提取菌液DNA,4℃备用。取上一步制备好的致病菌DNA 为模板,16S r RNA通用引物根据文献[6]由上海生工合成,进行PCR扩增试验。该试验采用细菌16S r RNA 通用引物和50μL 反应体系,即反应条件:95℃5 min;95℃30 s,57℃30 s,72℃1 min,共35 个循环;72℃10 min,4℃备用。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测观察并记录结果,并将剩余PCR 产物送到上海生工生物工程有限责任公司测序。

表1 PCR 引物序列

1.11 同源性及进化树分析将测序结果在Gen-Bank进行Blast。选取同源性相近的几条序列,用DANMAN V6软件对选取的序列进行编辑,并构建系统进化树分析结果。

2 结果

2.1 致病菌分离纯化在LB培养基涂片染色镜检可见有革兰阴性短杆菌,散落存在,偶见成对出现(图1)。

图1 细菌镜检照片(1 000×)

2.2 致病性试验攻毒4 h,注射菌液的小鼠,出现精神萎靡、躁动不安、闭眼发蔫等症状。8 h 左右,出现死亡,其他组和对照组的小鼠未出现任何症状。对死亡小鼠进行剖检,可见小鼠内脏有针尖大小的出血点,胸腔有少量的积液。将其内脏触片染色,油镜下观察,可见革兰阴性短杆菌,无芽孢。与注射菌液涂片为形态学相同的同一种菌,确定该菌为导致犊牛腹泻的致病菌。

2.3 致病菌的菌落生长特性将该致病菌分别平板划线到血液琼脂培养基和麦康凯培养基,37℃厌氧培养12 h,血液琼脂培养基上可见圆形、边缘整齐,表面光滑湿润,灰白色的溶血性菌落,溶血直径在10~15 mm;而接种到麦康凯培养基上,可见到粉红色的单个菌落生长,该致病菌为疑似大肠杆菌(图2)。

图2 麦康凯上的粉红色单菌落

2.4 生化及药物敏感性试验待仪器检测完成后观察其结果,根据该菌株对L-阿拉伯醇、β-葡萄糖苷酶和侧金盏花醇等阴性以及D-甘露醇、L-脯氨酸芳胺酶和赖氨酸脱羧酶等阳性生化结果(表2);并对阿米卡星、亚胺培南、美洛培能、哌拉西林4种药物敏感,对庆大霉素、头孢唑肟和头孢他啶等13种药物耐药的药敏结果(表3),最终BD PhoenixTM100全自动微生物生化/药敏鉴定仪的鉴定结果为大肠杆菌。

2.5 分离致病菌O 抗原鉴定结果观察到只有O132血清与待测抗原出现强烈阳性凝集反应,确定该致病菌株为O132型大肠杆菌。

2.6 16S rRNA PCR鉴定16S rRNA PCR产物经由1%琼脂糖凝胶电泳后,结果显示在1 000~2 000 bp间有1条清晰明亮的目的条带(图3)。经测序后,16S r RNA PCR 产物大小为1 445 bp。将测序序列(DG)在NCBI网站进行Blast同源性比对,该致病菌株为大肠杆菌。

2.7 同源性及进化树分析选取相近的序列经过系统进化树的分析,测序序列(DG)与人腹泻的肠膜分离(CP024978.1)、患者粪便分离(CP024992.1)大肠杆菌的亲源性达100%,但与其他健康人体、动物体内或自然界分离出的大肠杆菌存在较大的差异(图4)。

3 讨论

经过从腹泻犊牛粪便分离出疑似犊牛感染发病致病菌,通过形态学观察、细菌的分离培养及纯化、生化试验、动物致病性试验、O 抗原鉴定、16S r RNA PCR 的分子生物学试验以及系统进化树分析等一系列鉴定方法,证明引起犊牛腹泻的致病菌为大肠杆菌O132型。

大肠杆菌属于条件致病菌,在畜牧业的日常预防中不能忽视,需要相关工作人员引起重视。当动物感染该菌发病时主要以腹泻症状为临床表现,严重的脱水死亡。肠系膜淋巴结肿大,肝、肾苍白,包膜下有出血点。有腹泻症状者,胃肠黏膜呈现出血性炎症变化[7]。发病时可分离致病菌后做药敏试验来选择有针对性治疗的抗生素,例如该例犊牛腹泻就通过药敏试验结果,可以选用阿米卡星、哌拉西林两种药物进行治疗。同时在药物防治方面,不要盲目的长期大剂量使用某种药物,以免造成耐药菌株的出现[8]。

分离鉴定的大肠杆菌菌株进化树分析,可见该菌株与人腹泻肠膜分离、患者粪便分离大肠杆菌株的亲源性达100%。可推断出该例犊牛腹泻与养殖户日常管理混乱有关,没有将养殖人员生活区与养殖区进行划分,造成人与牛只的交叉感染,导致了该病的发生。

表2 致病菌生化试验结果

表3 菌株药物敏感性试验结果

图3 16S rRNA PCR 扩增电泳结果 1.PCR 产物;M.DL2000 DNA Marker

图4 大肠杆菌分离株系统进化树

近年来国内外科研工作者们在大肠杆菌的研究中投入了大量人力和财力,取得了一定的成就。但在牛业养殖过程中仍无法彻底根治该病,这在一定程度上限制了我国牛业的发展。为了预防该病,在日常牛舍管理中可以通过提高饲养水平,远离人员居住环境,搞好舍内卫生,定期注射疫苗,以及抗生素治疗来减少犊牛腹泻的发病率及死亡率[9]。犊牛应在出生后立即吃到健康母牛的初乳,初乳中含有的多种母源抗体可以给犊牛提供一定的免疫能力。除了健康初乳,还要在出生的1周后进行疫苗的注射;还可以将一些含有益生菌的微生态制剂和中草药制剂(黄芪多糖、复方诃子口服液)加入到牛只日常的饲料、饮水中,调节犊牛的胃肠道菌群的生态平衡,提高牛只自身的免疫水平,起到良好的保护效果[10]。

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