类志贺邻单胞菌感染对鲟鱼肠道菌群多样性的影响

胡安东,张明洋,张 飘,杨 霞,程振涛,姜海波,文 明 (贵州大学 动物科学学院 贵州省动物疫病

与兽医公共卫生重点实验室/贵州省动物生物制品工程技术研究中心,贵州 贵阳550025)

贵州省处于长江和珠江两大水系上游交错地带,水资源丰富,水质优良,水温常年恒定,是最适宜于冷水鱼养殖的省份之一。目前,贵州省已形成以铜仁市、安顺市为主的环梵净山及黔中地区冷水鱼产业带,养殖的冷水鱼品种主要有虹鳟、金鳟及俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、史氏鲟、杂交鲟等。但随着冷水鱼养殖产业的规模化与集约化发展,冷水鱼疾病发生亦日趋严重,其中以细菌性疾病最为常见。

类志贺邻单胞菌(Pseudomonas shigella)是一种具鞭毛、无荚膜的革兰阴性杆菌,广泛分布于淡水环境中,是威胁和危害冷水鱼养殖健康发展的重要病原菌之一[1]。据资料报道,肠道菌群种类结构与鱼类疾病发生以及免疫应答存在密切关系,病原菌感染宿主后,受到宿主肠道菌群的拮抗作用,同时也影响着肠道菌群结构动态变化,从而导致宿主康复或病程加重[2-3]。但目前关于类志贺邻单胞菌感染对鲟鱼肠道菌群的影响研究鲜有报道。因此,本研究通过高通量测序技术开展类志贺邻单胞菌感染对鲟鱼肠道菌群多样性的影响研究,以期为类志贺邻单胞菌感染的微生态防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与菌株试验用杂交鲟30尾,为体质量(200±15)g的1岁龄杂交鲟,购自贵州省水产研究所惠水基地；杂交鲟随机分为2组,即感染组和对照组,每组15尾,试验前于18～20℃淡水循环系统中驯养2周,确保健康无病后方可试验。

试验用细菌,为类志贺邻单胞菌GZH 株,由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室从感染发病死亡的杂交鲟体内分离、鉴定及保存[4]。试验前,取菌种于TSB 液体培养基培养24 h,3 000 r/min离心10 min,取沉淀,PBS缓冲液悬浮并调整其浓度为5×107CFU/m L。

1.2 人工感染及样品采集试验前用甲磺酸三卡因(MS-222)对杂交鲟进行麻醉,感染组鲟鱼腹腔内注射细菌悬浮液500μL(细菌含量1×105CFU/m L),对照组鲟鱼腹腔内注射PBS缓冲液500μL；感染组鲟鱼在注射后24 h 出现活力减弱、肛门红肿、腹部发黄,对照组无临床症状；无菌解剖感染组与对照组鲟鱼,感染组腹腔内壁和肝脏有出血点,对照组无变化；分别收集鲟鱼肠道内容物,保存于液氮罐中备用。

1.3 鲟鱼肠道内容物DNA 提取取适量肠道内容物,ASL 缓冲液充分混匀,以QIAamp Stool DNA试剂盒(Qiagen,CA)提取细菌DNA,－20℃冰箱保存备用。

1.4 鲟鱼肠道菌群16S r RNA基因高通量测序采用16S r RNA 基因PCR 试剂盒(上游引物967F：5′-CAACGCGAAGAACCTTACC-3′和下游引物1064R：5′-CGACAGCCATGCANCACCT-3′)进 行扩增,反应体系为50μL,包括10×PCR Gold缓冲液5.0μL、MgCl2(25 mmol/L)5.0μL、脱氧核苷三磷酸(10 mmol/L)1.0μL、上下游引物各1.25μL、Amplitaq Gold LD 聚合酶0.5μL、细菌DNA 样本10.0μL和无核酸酶水26.0μL。反应条件：93℃预变性15 min；进入95℃变性30 s、57℃退火30 s和72℃延伸60 s的30个循环；最后72℃延伸10 min。当所有样品PCR 扩增成功后,各个样本PCR 产物应用Qiagen PCR 纯化试剂盒进行纯化和PicoGreen定量检测,建库后应用Illumina Miseq测序平台进行测序。

1.5 数据处理与分析测序得到的DNA 序列应用RDP(Ribosomal Database Project)数据库进行比对和OUT 分类。对已知菌属,计算16S r DNA 所有可能的8个碱基亚序列频率并作训练集,当查询序列最大化观察特定属所有子序列概率时分配层级,并使用ESPRIT 进行OUT 分配；当STAP 使用BLAST 选择与查询序列相关序列,构建最大似然树以进行初始分配,并构建另一个系统发育树以进行最终分类。

2 结果

2.1 感染鲟鱼肠道菌群测序数据处理情况经Illumina Miseq平台测序和质控过滤筛选,对照组平均获得原始reads 128 382 条,感染组获得原始reads 126 669 条；经reads拼接和再次质控过滤筛选,对照组平均获得Tags 127 536条,感染组获得Tags 125 811条；经Tags嵌合体去除,最终对照组平均获得有效Tags 123 584 条,感染组获得有效Tags 121 199条(表1,图1)。利用Mothur软件包进行Tag序列去冗余处理,对照组平均获得Unique Tags 41 477条,长度累计18 877 090 bp,最长序列为478 bp,最小序列为358 bp；感染组平均获得Unique Tags 39 759条,长度累计18 047 296 bp,最长序列为477 bp,最小序列为429 bp。

表1 鲟鱼肠道菌群高通量测序序列处理结果

图1 鲟鱼肠道菌群高通量测序序列处理结果 CG.对照组；IG.感染组。下同

2.2 感染鲟鱼肠道菌群Alpha多样性分析Alpha多样性分析结果显示,除Good’s Coverage指数外,感染组鲟鱼肠道菌群的Chaol指数、ACE 指数、observed_species指 数、Shannon 指 数 和Simpson 指数均显著低于对照组(P＜0.05),表明类志贺邻单胞菌感染能导致鲟鱼肠道菌群的物种多样性和均匀度显著下降(表2,图2)。

2.3 感染鲟鱼肠道菌群Beta多样性分析Beta多样性分析结果显示,对照组鲟鱼肠道共有261 条OTUs(operational taxonomic units),而感染组鲟鱼肠道共有235条OTUs,相对减少26条OTUs；对照组鲟鱼肠道特有OTUs为109条,而感染组肠道特有OTUs为83条,两者肠道共有OTUs为152条(图3),说明感染组和对照组鲟鱼肠道菌群差异显著(P＜0.05)。

2.4 感染鲟鱼肠道菌群种类分布将鲟鱼肠道菌群Tags进行归类,得到分类树图(图4),结果显示：感染组和对照组鲟鱼肠道菌群均分布于梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteriodia)和厚壁菌门(Firmicute),其丰度大小依次为50.56%,32.77%,11.69%,4.98%,其中感染组鲟鱼肠道拟杆菌门细菌丰度显著小于对照组(P＜0.05),而变形菌门(特别是邻单胞菌属)细菌丰度显著大于对照组(P＜0.05)。

表2 对照组和感染组鲟鱼肠道菌群Alpha多样性分析

图2 对照组和感染组鲟鱼肠道菌群Alpha多样性分析图

2.5 感染鲟鱼肠道菌群种类差异通过LEFse分析,结果如图5,表3,4所示,感染组鲟鱼肠道菌群差异物种主要分布于变形菌门和放线菌门(主要是分枝杆菌属和棒状杆菌属),而对照组鲟鱼肠道菌群差异物种主要分布于厚壁菌门和梭杆菌门,其中感染组鲟鱼肠道类志贺单胞菌丰度极显著提高(P＜0.01),说明通过腹腔注射感染,能显著增加鲟鱼肠道类志贺单胞菌含量。

图3 对照组和感染组鲟鱼肠道菌群OUT 对比

图4 对照组和感染组鲟鱼肠道菌群种类分布图

图5 对照组和感染组鲟鱼肠道菌群种类差异Lefse分析图

表3 对照组鲟鱼肠道菌群差异物种统计

续表3

表4 感染组鲟鱼肠道菌群差异物种统计

3 讨论

动物肠道含有种类繁多、数量庞大的微生物群体,包括细菌、真菌和病毒等[5]。在正常情况下,肠道菌群种类间以及菌群与宿主间处于动态平衡状态,维系着动物肠道正常生理功能[6]。但当病原微生物感染时,可能打破动物肠道菌群动态平衡状态,影响肠道免疫系统功能,导致某些条件致病菌感染,从而加重感染动物病情或病变程度,引起感染动物死亡。因此,开展动物肠道微生态研究,对维护动物健康具有重要意义。

近年来,贵州省大力发展冷水鱼养殖产业,形成了冷水鱼产业带,其中鲟鱼是贵州省主要的冷水养殖鱼类。在鲟鱼养殖过程中,细菌性感染是最常遇到的疾病问题,常给冷水鱼养殖产业造成严重的经济损失,其中类志贺邻单胞菌是冷水鱼养殖过程中最常见的病原细菌,可引起鲟鱼肛门红肿、排黄色分泌物、腹腔有大量腹水、腹壁出血、肝脏点状出血和脾脏肿大等。研究表明,病原微生物感染可导致鱼类肠道菌群发生紊乱[7],但类志贺邻单胞菌感染对鲟鱼肠道菌群结构有何影响尚未清楚。

本研究利用Miseq高通量测序技术研究了类志贺邻单胞菌感染对鲟鱼肠道菌群的影响,结果显示类志贺邻单胞菌感染能使鲟鱼肠道菌群的多样性分析指数包括Chaol、ACE、Observed_species、Shannon和Simpson等显著降低,说明该细菌感染后可导致鲟鱼肠道菌群结构即微生态系统发生紊乱；同时发现,类志贺邻单胞菌感染后,鲟鱼肠道拟杆菌门细菌丰度显著降低,而变形菌门细菌特别是邻单胞菌属细菌显著提高。这些变化可能是类志贺邻单胞菌感染导致鲟鱼肠道菌群生态环境发生改变(p H值、营养物质减少、代谢产物增多等)而引起肠道菌群改变；也可能与类志贺邻单胞菌感染导致鲟鱼肠道组织免疫系统发生改变,从而引起肠道菌群结构发生改变,这需进一步证实。

前人研究显示,脊椎动物肠道的优势菌门是厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes),优势菌属为气单胞菌属(Aeromonas)、黄杆菌属(Falvobacteria)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠杆菌属(Enterbactes)、芽抱杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和鲸杆菌属(Cetobacterium)等[8]。朱文艮等[9]研究草鱼肠道菌群结构时发现其优势菌门主要是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺旋体门(Spirochaete)和变形菌门(Proteobacteria)等。本研究对类志贺邻单胞菌感染后鲟鱼肠道菌群结构影响发现,鲟鱼肠道主要优势菌门是梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteriodia)和厚壁菌门(Firmicute),主要优势菌属为芽孢杆菌属(Bacillus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、鲸杆菌属(Cetobacterium)和气单胞菌属(Aeromonas),这与前面研究结果基本一致,说明病原感染引起鱼类肠道发生类似的菌群结构改变。同时本研究发现,类志贺邻单胞菌感染后鲟鱼肠道菌群物种差异主要分布在分枝杆菌属和棒状杆菌属,提示这两个属细菌可能是类志贺邻单胞菌感染引起鲟鱼肠道菌群改变的特征,但有待进一步验证。

综上所述,类志贺邻单胞菌感染会造成杂交鲟肠道正常菌群紊乱,使肠道微生态失衡,导致疾病的发生。对此,可根据微生态学原理,从健康杂交鲟肠道中分离出对杂交鲟有益的正常微生物及其代谢产物和生长促进物质制成制剂进行投喂,使其通过竞争性抑制作用与致病菌争夺肠道黏膜的黏附位点和介导调节肠道免疫应答等方式抑制病原菌的增殖,以维持杂交鲟肠道微生态平衡。本研究为类志贺邻单胞菌感染对鲟鱼肠道菌群多样性的研究提供了基础资料,并为类志贺邻单胞菌感染的微生态防控提供理论依据。