猪伪狂犬病病毒变异株gE/gI/TK三基因缺失突变株的构建及纯化

张 宇，刘 芳，田润博，郑慧华，赵 宇，徐朋丽，韩昊莹，张鸿鑫，崔建涛，陈红英

(河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

伪狂犬病(pseudorabies,PR)，即奥耶兹病(Aujeszky’s disease)，是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起牛、羊、猪等多种家畜及野生动物的一种急性传染病[1-2]。猪是PRV的天然宿主和最主要的传染源，各年龄阶段的猪均可被PRV流行株感染，且成年猪的隐性感染引发长期带毒、排毒现象，给PR的防制和根除带来了巨大的困难[3]。目前,对PR进行防控主要依靠疫苗接种免疫[4]。20世纪90年代，我国猪场普遍用从匈牙利引进了PRV Bartha-K61株制备的该疫苗进行防疫[5-6]，使该病在我国得到了有效地控制。

自2011年底，我国许多规模化猪场免疫过PR疫苗的猪群中出现PR疫情的大流行[7-8]。许多学者已从免疫过PR疫苗的死亡仔猪和流产胎儿中分离到PRV，并对其进行测序与比对。结果显示，PRV流行株处于一个相对独立分支，与以往国内外的PRV分离株及Bartha-K61等常用疫苗株的遗传关系较远，且对仔猪的致病性更强[4,9]。PRV流行株的抗原性已经发生了变异，Bartha-K61等常用疫苗株已不能完全保护PRV流行变异株的感染[9-11]。

TK基因是PRV最主要的毒力基因，许多未缺失TK基因的弱毒疫苗，使用中可能存在毒力返强的可能性，还可能会引起潜伏感染的危险[12]。此外，缺失TK基因不仅可明显降低PRV的侵染力、传播力和毒力，且仍能使PRV保持良好的免疫原性。因此，考虑到弱毒株的安全性问题，本试验在PRVgE/gI双基因缺失毒株的基础上，进一步进行TK基因的缺失以期望将其用于防控当前PRV变异毒株的疫情中，为我国根除PR创造条件。

1 材料与方法

1.1 质粒、病毒、细胞和试验动物PRV转移质粒pG由郑州市猪重大疫病防控重点实验室构建，其中(PstⅠ-PstⅠ)部分含有完整的绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒，包括CMV、EGFP、MCS、SV40 PolyA尾基因片段，大小为1 672 bp；载体pMD 18-T和pUC19购自宝生物工程(大连)有限公司。PRV变异株gEgI双基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-由郑州市猪重大疫病防控重点实验室构建，以2012年分离的PRV NY变异株为亲本株，缺失其gE/gI双基因而构建；猪睾丸(ST)细胞购自中国兽药监察所；猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)购自哈尔滨维科生物技术开发公司；6周龄小白鼠购自河南省实验动物中心。

1.2 主要试剂2×Taq Master Mix酶和DNA凝胶回收试剂盒购自康为世纪生物技术生物技术有限公司；EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ等限制性内切酶、T4DNA连接酶、XfectTMTransfection Reagent购自宝生物工程(大连)有限公司；UNIQ-10柱式病毒基因组抽提试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；OMEGA E.Z.N.A.TMEndo-Free Plasmid Mini KitⅠD6948-01B购自OMEGA公司；DMEM购自武汉博士德生物公司；2×DMEM、低熔点琼脂糖购自索莱宝科技有限公司。

1.3 转移质粒构建技术路线图见图1。

图1 转移质粒构建示意图

1.4 左右同源臂的引物设计与合成参考PRV TJ株UL区基因序列(GenBank登录号：KJ789182)，设计2对特异性引物，分别用于左右同源臂的扩增，其中左同源臂包括部分UL24基因和部分TK基因；右同源包括部分TK基因和部分UL22基因，下划线部分为上下游引物5′端的酶切位点(表1)。针对左右同源臂，设计了1对特异性引物TKQS/F和TKQS/R，用于TK基因缺失部分的PCR鉴定。此外，设计1对特异引物gB/F和gB/R，扩增gB全基因，用于鉴定重组病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 同源臂扩增所需引物信息

注：F表示上游引物，R表示下游引物

1.5 左右同源臂的克隆用UNIQ-10柱式病毒基因组抽提试剂盒提取PRV NY株DNA。利用2对特异性引物TKL/F和TKL/R、TKR/F和TKR/R，分别扩增TK基因缺失部分两侧的序列，作为左右同源臂。分别将回收纯化的PCR产物克隆到载体pMD18-T中，构建重组质粒pMD-TKL和pMD-TKR并进行测序，所测的序列通过NCBI Blast进行比对，以确定左右同源臂序列的正确性。

1.6 转移质粒pUC-TKLRE的构建与鉴定用Q.Cut HindⅢ和Q.Cut PstⅠ对重组质粒pMD-TK进行酶切，回收纯化目的片段亚克隆到同样处理的载体pUC19中，构建重组质粒pUC-TKL。用Q.Cut EcoRⅠ和Q.Cut PstⅠ对重组质粒pMD-TKR进行酶切，回收纯化目的片段亚克隆到同样处理的质粒pUC-TKL中，构建重组质粒pUC-TKLR。用HindⅢ、PstⅠ对重组质粒pUC-gE/gILR进行酶切鉴定。

用Q.CutPstⅠ酶切质粒pG释放出EGFP基因表达盒，回收纯化目的片段克隆到同样处理的质粒pUC-TKLR中，构建重组质粒pUC-TKLRE。用PstⅠ对重组质粒pUC-TKLRE进行酶切鉴定后，-20℃保存备用。

1.7 rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+三基因缺失株的构建

1.7.1转染 当ST细胞融合度达到70%左右时，参照XfectTMTransfection Reagent试剂说明书将rPRV NY-gE-/gI-株DNA与转移质粒pUC-TKLRE进行共转染到ST细胞中。转染后约4 h时，移除转染液，换为2 mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液，置37℃、5%CO2培养箱中继续培养48 h，反复冻融3次收取病毒液，3 000 r/min离心5 min。取上清液，-80℃保存备用。

1.7.2重组病毒的空斑纯化与鉴定 当ST细胞融合度达到90%时，将10-2～10-7稀释度的上述病毒液分别接种到六孔板中，并用低熔点营养琼脂铺板，进行重组病毒的蚀斑筛选。挑选在荧光显微镜蓝光下观察到最大绿色荧光蚀斑，反复冻融3次，进行下一轮蚀斑的筛选，直至在蓝光条件下观察到的所有病毒蚀斑均可呈现绿色荧光。将拯救得到的病毒命名为rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+。利用特异性引物TKQS/F和TKQS/R，对重组病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+进行PCR鉴定，PCR反应参数为：95℃ 5 min；95℃ 50 s；59℃ 45 s；72℃ 150 s，共35个循环；72℃终延伸10 min；4℃ 10 min。将回收纯化的PCR产物进行序列测定，验证TK基因上缺失的序列。再用gB全基因特异引物gB/F和gB/R，对rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+进行gB基因的扩增。

1.8 重组病毒的生长特性将rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+、rPRV NY-gE-/gI-、弱毒疫苗Bartha-K61株以及亲本病毒PRV NY株分别以10 μL(106.0TCID50/0.1 mL)剂量接种单层ST细胞的24孔板中。接种病毒4 h后，开始每隔2 h收取细胞及其上清培养液，反复冻融3次，进行TCID50值的测定。根据结果绘制出病毒的一步生长曲线，并进行分析。

1.9 小鼠安全性试验将40只生长健康的6周龄SPF雌性小鼠随机分为4组，每组10只，试验具体分组和接种情况见表2，接种途径为背部皮下分点注射。接种后，每天观察并记录小鼠临床反应情况。

表2 试验鼠分组及免疫情况

2 结果

2.1 左右同源臂的克隆结果用2对特异性引物TKL/F和TKL/R、TKR/F和TKR/R，分别进行PCR扩增、电泳。结果显示，分别扩增出了1条约1 000 bp 的片段(图2)，与预期结果相吻合。测序结果显示，左、右同源臂片段大小分别为967 bp和976 bp。NCBI Blast比对结果显示，左、右同源臂与PRV TJ株UL区基因同源性均高达99.9%，表明成功获得同源臂序列。

图2 同源臂的扩增 M.DL2000 DNA Marker；1.左同源臂(TKL)；2.右同源臂(TKR)；3.阴性对照

2.2 转移质粒的酶切鉴定重组质粒pUC-TKLR经HindⅢ、PstⅠ酶切后，电泳结果显示出现了2条带，1条为插入的左同源臂，位置约为1 000 bp；另外1条为右同源臂与pUC-19载体通过EcoRⅠ位点相连的片段，约为3 700 bp(图3)，与预期结果相符。

转移质粒pUC-TKLRE经PstⅠ进行酶切，电泳结果显示出现了2条带，一条为插入的含EGFP基因的(PstⅠ-PstⅠ)酶切片段，约为1 700 bp；另外一条带，包括左、右同源臂和pUC-19载体，约为5 200 bp(图3)，与预期结果相一致。

图3 转移质粒的酶切鉴定图 M.DL5000 DNA Marker；1.pUC-TKLR的HindⅢ/PstⅠ酶切产物；2.pUC-TKLRE的PstⅠ酶切产物

2.3 rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+的拯救与PCR鉴定将rPRV NY-gE-/gI-基因组与转移质粒pUC-TKLRE进行共转染，48 h后收获病毒液。用10倍稀释法进行蚀斑筛选。每次纯化时，挑取最大稀释倍数孔中的最大绿色荧光蚀斑(图4)，经4轮蚀斑纯化，所有病毒蚀斑均表达绿色荧光。表明重组病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+已纯化完全。

以rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+和rPRV NY-gE-/gI-株DNA为模板，利用特异性引物TKQS/F和TKQS/R，对左右同源臂间的缺失部分进行PCR鉴定，结果显示rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+株DNA扩增出了1条约2 100 bp的片段(包括 414 bp和1672 bp EGFP基因表达盒，图5泳道2)，未缺失TK基因的rPRV NY-gE-/gI-株DNA扩增出了1条约725 bp的片段(包括414 bp和311 bp，图5泳道1)，与预期结果相符。测序结果显示，获得的三基因缺失株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+在TK基因上缺失了311 bp，并在缺失部位插入了含EGFP基因的PstⅠ-PstⅠ片段(1 672 bp)。

利用gB全基因特异引物，对重组病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+进行鉴定。结果显示，扩增出了1条约3 000 bp的片段(图6)，与预期结果相符。

图4 不同光照下观察到的蚀斑照片 A.常光下rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+形成的蚀斑； B.蓝光下rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+形成的蚀斑

图5 TK缺失部分PCR鉴定结果 M.DL5000 DNA Marker；1.rPRV NY-gE-/gI-的缺失鉴定结果；2.rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+的缺失鉴定结果；3.阴性对照

图6 重组病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK-/EGFP+ gB基因的鉴定 M.DL5000 DNA Marker；1、2.rrPRV NY-gE-/gI-/TK-/EGFP+的gB基因鉴定结果；3.阴性对照

2.4 重组病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+的生长特性结果根据各个时间点的TCID50测定结果绘制一步生长曲线(图7)。三基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+、双基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-以及弱毒疫苗Bartha-K61株，与亲本病毒PRV NY株具有非常相似的生长动力学，但体外生长动力学比亲本毒株弱：在感染细胞后10～14 h时，PRV NY株的增殖速度极快，而三基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+、双基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-和弱毒疫苗Bartha-K61株的增殖速度和病毒滴度都低于亲本株。

2.5 小鼠安全性试验对小鼠进行接种后，DMEM(A组)、Bartha-K61(B组)和rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+(C组)免疫组小鼠均未出现不良症状，全部存活；而rPRV NY-gE-/gI-(D组)免疫组小鼠在接种72 h后陆续出现精神低沉、发痒抓挠等典型的PR发病症状，96 h内D组小鼠全部死亡。

图7 缺失病毒和亲本毒株的一步生长曲线

3 讨论

PRV庞大的基因组中包含许多对其毒力有影响的基因。TK基因是PRV最主要的毒力基因，主要参与病毒在神经组织细胞中的增殖和复制过程，且对病毒在机体内维持长期的潜伏感染以及潜伏感染期病毒的复活过程都起到了关键性作用[13]。TK基因的缺失不仅引起PRV毒力丧失或极显著地降低，同时也能降低其在神经组织中的复制、传播以及引起脑炎的能力[14]。临床上，未缺失TK基因的PRV基因缺失疫苗存在毒力返强的可能性，还可能引起潜伏感染的危险，而且引发非靶动物感染PRV的报道屡见不鲜。KONG等[15]报道，普遍使用的PRV弱毒活疫苗Bartha-K61引起绵羊出现狂躁、神经性瘙痒、发热等发病症状。XIN等[16]报道，构建的双基因缺失疫苗rPRV TJ-gE-/gI-对靶动物猪是非常安全的，而对羊却是有毒性的。安全性和免疫性试验证实，缺失TK基因后获得的PRV三基因缺失疫苗对小鼠、绵羊和猪均安全且有效。由于我国猪场大多环境条件恶劣，管理不到位，猪场内也常有鼠、狗、猫等动物。如果猪场使用未缺失TK基因的PRV疫苗，则有可能引起非靶动物感染PRV等生物安全隐患。因此，本研究对PRV双基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-进一步进行TK基因的缺失。

合适长度的同源臂是保证同源重组顺利进行的基础[17]。本试验根据PRV UL基因序列，设计2对引物，扩增TK基因两侧序列(作为左右同源臂)，左右同源臂分别为967 bp和 976 bp。PCR扩增PRV NY株TK基因两侧序列，以EGFP基因作为筛选基因，构建转移质粒pUC-TKLRE。以rPRV NY-gE-/gI-株为亲本株，将转移质粒pUC-TKLRE转染ST细胞，通过同源重组、绿色荧光蚀斑纯化，获得表达荧光蛋白的PRV变异株gE/gI/TK三基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+。对重组病毒的PCR鉴定及PCR产物测序证实，rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+三基因缺失株在TK基因上缺失了311 bp，并在缺失部位插入了含EGFP基因的PstⅠ-PstⅠ片段，表明本试验构建的转移质粒左右同源臂长度完全可以满足同源重组的需要。

本试验测定了rPRV NY-gE-/gI-双基因缺失株、rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+三基因缺失株与亲本株PRV NY以及Bartha-K61弱毒株在ST细胞上的体外生长曲线，结果表明4种毒株在ST细胞上的生长动力学并没有明显差异，但增殖速度和病毒滴度都低于亲本株PRV NY。本试验结果表明，gE、gI、TK基因作为PRV复制的非必需基因，虽然缺失后在一定程度上影响了病毒在ST细胞上的生长速率，但是仍能与亲本株一样在ST细胞上呈现良好的增殖情况，从而保证了较高的病毒滴度。此外，rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+接种组的小鼠没有出现任何不良反应，初步证实该三基因缺失病毒对非靶标动物小鼠是安全的；而rPRV NY-gE-/gI-免疫组小鼠全部死亡，说明rPRV NY-gE-/gI-双基因缺失毒还存在一定的毒力，但还需要对病毒接种剂量进行进一步地探究。

本试验成功构建了PRV三基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+，并具有良好的增殖特性，且对非靶标动物小鼠是安全的。下一步敲除引入的EGFP标记基因，从而获得不携带外源基因的rPRV NY-gE-/gI-/TK-。此外，还将对rPRV NY-gE-/gI-/TK-的遗传稳定性、rPRV NY-gE-/gI-/TK-对靶动物和其他非靶标动物的安全性、在妊娠母猪和新生仔猪上的免疫效力以及免疫持续期等进行系统评价，为防控当前PRV变异毒株引起的PR疫情，以及构建伪狂犬变异株的二价和多价基因工程疫苗提供基础。