羊传染性脓疱病毒122蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

周帅帅，关继羽，张 竞，周艳龙，刘 芳，高 宇，赵 魁，高 丰，贺文琦

(吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

羊传染性脓疱病在我国西北、东北等广大养羊地区广泛存在，对我国养羊产业造成巨大损失，该病俗称“羊口疮”，是由痘病毒科副痘病毒属的羊传染性脓疱病毒(Orf virus ORFV)所引起的一种急性、高度接触性的人兽共患传染病。ORFV有较强的嗜上皮性，在病毒感染早期主要是在被感染病畜的口鼻部、外阴部以及母畜的乳房等一些重要部位出现明显的红疹、丘疹、水泡等临床体征和症状，随着病情的进一步发展加剧会逐渐的形成较大的脓疱甚至会生成厚厚的结痂。羊传染性脓疱病虽然在成年羊群中造成的病死率较低，但在羔羊中的病死率很高，因为羔羊在吃乳的过程中通过母体而被感染，其主要感染是在口腔及唇舌等部位。由于口腔等处生成了水泡或脓疱造成了羔羊的采食障碍，所以对羔羊的生长性能带来了严重影响，有时也会引起继发性细菌感染会使病情进一步恶化，导致羔羊的死亡[1]。

不同ORFV分离毒株基因组长度为136～138 kb 不等，约编码132个基因。ORFV基因组的中间区域基因较为保守，多与病毒粒子结构和病毒组装有关。两末端为反向重复序列，基因结构变异较大，多与病毒的毒力、致病性以及免疫调节功能密切相关。病毒的整个基因组呈现环状并在交汇处存在发卡结构，在扫描电镜下可见病毒粒子为椭圆形并在其自身表面存在相互交错的网状结构[2-4]。该病毒在宿主细胞的细胞质中完成自身的复制过程，并在高尔基体上形成囊膜，最后通过使宿主细胞的破裂得以重新释放。

研究人员已经阐明了一些ORFV的毒力基因的致病机制[5-6]。如ORFV132基因所编码合成的血管内皮生长因子，该因子作用于宿主机体时可促进内皮细胞的快速增殖，这就为病毒复制提供细胞底物[7]。ORFV125基因是抗凋亡基因，该基因编码生成的蛋白与Bcl-2家族中的Bak有着相似的表面结构可以竞争性抑制凋亡的激活，所以该基因的表达可以防止病毒感染细胞的凋亡。ORFV117基因编码的粒细胞-巨噬细胞集结刺激因子抑制因子可以和IL-2结合并抑制其生物活性进而减弱机体的免疫应答，减缓机体对病毒的杀灭作用。ORFV112基因是一种毒力基因，在毒性和发病机制中发挥关键作用，ORFV将CBP分泌到皮肤上皮细胞中,竞争性地抑制趋化因子与同源受体的相互作用,从而抑制趋化性和白细胞募集[8]。还有ORFV002,ORFV024和ORFV121基因所编码合成的产物是 NF-kB信号通路的抑制剂，抑制宿主细胞中NF-KB信号传导途径的不同过程，有助于ORFV逃避宿主细胞的免疫反应[9-13]。虽然通过前人的研究已经对ORFV一些基因功能有所了解，但是依然还有许多基因的功能有待于我们去发掘。如位于末端可变区的ORFV122基因就是功能未知基因。为了对ORFV122基因的功能做进一步的研究就要做好前期的物质准备。所以在本研究中，我们纯化得到了ORFV122蛋白并免疫小鼠得到了多克隆抗体，为后续的ORFV122基因研究做好物质准备。

1 材料与方法

1.1 病毒和质粒羊传染性脓疱病病毒ORFV-SY17、原核表达载体PET-28a均由本实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器DL2000 DNA Marker、Primerstar Max、T4DNA连接、青霉素、链霉素、胎牛血清购自以色列Biological Industrues公司；镍离子亲和层析柱购自美国ThermoFisher生物公司；琼脂糖核酸胶回收试剂盒、大肠杆菌质粒提取试剂盒购自大连宝生物科技有限公司；异丙基2-β2-D硫代半乳糖苷(IPTG)、考马斯亮蓝等均购自上海生工生物工程有限公司；蛋白浓缩柱购自美国密理博公司；转染试剂Lipofectamine3000购自美国sigma公司；病毒DNA提取试剂盒购自德国analytik jena生物科技公司。

1.3 目的蛋白结构分析使用蛋白生物学分析软件DNAstar对ORFV122蛋白的基本生物信息进行分析，对ORFV122蛋白的抗原位点、亲水区、疏水区等信息进行预测[14]。通过Phyre2数据库对ORFV122蛋 白进行三级结构进行比对分析。

1.4 引物的设计与合成在基因数据库中找到目的基因序列,利用Primer Premire 5.0软件设计1对引物,ORFV122-F 5′-CCGGAATTCATGGCG-AACAGGCTCGTGTT-3′；ORFV122-R 5′-CCCA-AGCTTCTAACCGTCGATCTCCATGG-3′;扩增片段大小为972 bp。

1.5 ORFV122基因的扩增以提取的ORFV基因为模版，PCR扩增ORFV122基因。按实验室常规的25 μL体系与条件进行操作，设置6个重复。

1.6 重组表达质粒的构建使用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切PCR扩增出的ORFV122基因片段与PET-28a载体，并把酶切产物用T4连接酶进行连接。把连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态中，37℃培养1 h后把菌液均匀的涂在卡那板上。37℃培养箱培养过夜并挑取若干单个菌落扩大培养，并把菌液进行测序，把测序成功的菌液做保菌处理并放入-80℃冰箱保存。

1.7 目的蛋白的诱导表达在菌液测序成功后接种于800 mL含有100 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中。37℃、180 r/min摇床培养至D600=0.6～0.8时，加入IPTG诱导表达，收集菌液，并进行SDS-PAGE用于鉴定是否有目的蛋白的表达。

1.8 目的蛋白诱导表达条件的优化

1.8.1诱导时间的优化 将6支装有相同菌液的试管37℃、180 r/min摇床震荡培养至D600=0.6～0.8时，加入终浓度1 mmol/L IPTG分别诱导2，4，6，8，10，12 h。从每支试管中取等量的菌液制备SDS-PAGE样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析最佳诱导时间。

1.8.2诱导温度的优化 将6支装有相同菌液的试管摇床震荡培养至D600=0.6～0.8时，加入终浓度1 mmol/L的IPTG分别在16，18，20，25，30，37℃下诱导8 h。从每支试管中取等量的菌液进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析最佳诱导温度。

1.8.3IPTG诱导浓度的优化 将7支装有相同菌液的试管摇床震荡培养至D600=0.6～0.8时，加入终浓度分别0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2,1.5 mmol/L的IPTG 37℃摇床诱导8 h。从每支试管中取等量的菌液制备SDS-PAGE样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析最佳诱导剂浓度。

1.9 目的蛋白的表达、纯化和浓缩将800 mL表达目的蛋白的菌液37℃摇床培养至D600=0.6～0.8时，加入终浓度1 mmol/L的IPTG诱导表达8 h，待诱导时间结束后以6 000 r/min离心15 min收集菌体沉淀物。弃去上清，用PBS溶液重悬后超声裂解菌体，4℃、12 000 r/min离心10 min并收集上清，使用Ni+-IDA金属螯合蛋白质纯化柱纯化目的蛋白。按照其说明书进行纯化，收集洗脱液。并将收集的洗脱液置于蛋白浓缩柱进行浓缩，蛋白浓缩后置于-80℃冰箱保存备用。

1.10 目的蛋白免疫小鼠在一免时取等量的目的蛋白与弗氏完全佐剂混合然后置于震荡器上在四度的环境中震荡过夜，待其完全乳化后使用注射器吸取0.2 mL并在小鼠皮下多点注射。在第二免、三免以及四免过程中乳化剂使用的是弗氏不完全佐剂其余步骤与一免一致。

1.11 Western blot法检测抗体的特异性将目的蛋白制样后通过SDS-PAGE电泳之后再转移到固相载体PVDF膜上，在5%脱脂奶粉中37℃封闭。1 h 后将PVDF膜重新置于由PBST稀释的免疫血清中(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜。PBST洗3～5次，每次5～8 min。加入经PBST稀释的羊抗鼠IgG-HRP二抗(1∶10 000稀释)37℃孵育1 h后，PBST洗膜3次，每次5～10 min，然后用DAB显色分析。

2 结果

2.1 目的蛋白抗原预测结果根据软件DNAstar对目的蛋白二级结构、B细胞抗原表位、亲水性等参数的分析见图1，根据蛋白数据库信息比对可知目的蛋白三级结构见图2。通过以上分析目的蛋白有较好的亲水性，而且抗原指数得分也较高，故推测该目的蛋白作为抗原会产生较好的免疫应答。

图1 目的蛋白二级结构、B细胞抗原表位、亲水性等参数的分析结果(由上到下不同的区域依次代表了目的蛋白疏水区和亲水区、目的蛋白α螺旋、目的蛋白β折叠、 抗原性指数、目的蛋白表面可及性)

图2 目的蛋白三级结构建模

2.2 ORFV122基因PCR扩增提取ORFV的基因组，并将其作为模版，PCR扩增ORFV122基因。PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，与预期片段大小(972 bp)基本一致(图3)。

图3 PCR扩增ORFV122基因电泳图 M.DL2000 DNA Marker；1.ORFV122基因的扩增产物

2.3 重组表达质粒的构建及鉴定对固体培养基上挑取的10个阳性克隆进行菌液PCR鉴定(图4)以便排除假阳性。将可以扩增出目的基因的菌液送至公司进行测序，将测序结果与ORFV122基因进行比对，将比对一致的克隆进行质粒提取。

图4 重组质粒为模版PCR扩增ORFV122基因电泳图 M.DL2000 DNA Marker；1～10.挑取的10个阳性克隆的菌液PCR结果

2.4 目的蛋白诱导条件的优化

2.4.1目的蛋白诱导时间的优化 完成诱导后分别在不同试管中取相同菌液制备SDS-PAGE样品进行蛋白质凝胶电泳，检测结果是诱导8 h时蛋白的表达最优(图5)。

图5 目的蛋白在不同的诱导时间时考马斯亮蓝染色结果 M.蛋白质Marker；1～6.分别是在诱导2，4，6，8，10，12 h时考马斯亮蓝染色情况

2.4.2目的蛋白诱导温度的优化 分别在16，18，20，25，30，37℃下诱导6 h的试管中取等量的菌液，用菌液制备SDS-PAGE样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析最佳诱导温度是30℃(图6)。

图6 目的蛋白在不同的诱导温度时考马斯亮蓝染色情况 M.蛋白质Marker；1～6.分别是在16，18，20，25，30，37℃时考马斯亮蓝染色情况

2.4.3诱导剂IPTG诱导浓度的优化 分别在相应的试管中取相同菌液制备SDS-PAGE样品。经过SDS-PAGE检测发现当IPTG终浓度为1.0 mmol/L时诱导效果最好(图7)。

2.5 目的蛋白的纯化和浓缩在诱导结束后经过离心、超声、镍柱结合以及不同浓度咪唑溶液洗脱等过程纯化目的蛋白，结果显示在37 000处出现了目的条带(图8)，并把所得到的蛋白经蛋白浓缩柱浓缩，得到了纯度和浓度较高的重组蛋白,SDS-PAGE结果见图9。

图7 目的蛋白在不同的诱导浓度下考马斯亮蓝染色结果 M.蛋白质Marker；1～7.分别是在诱导剂浓度在0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5 mmol/L时考马斯亮蓝染色结果

图8 目的蛋白在不同的浓度的咪唑洗脱时考马斯亮蓝染色结果 M.蛋白质Marker；1～6.分别是浓度为40，60，80，120，160，200 mmol/L咪唑洗脱结果

图9 目的蛋白在纯化浓缩后SDS-PAGE结果 M.蛋白质Marker；1.纯化浓缩后的目的蛋白

2.6 抗体血清的采集在四免之后5～7 d对小鼠进行眼球采血并把血液放置4℃环境2～4 h，使其自动凝集析出血清，3 000 r/min离心10 min。并用注射器吸取上清注入新的离心管中，并放入-40℃冰箱保存备用。

2.7 抗体效价以及特异性的检测对多克隆抗体效价的检测我们采用间接ELISA的方法，通过目的蛋白包被、封闭、孵育一抗、二抗再加终止液终止反映，最后在酶标仪下测定450 nm处的吸光值。对数据进行处理得到多抗的效价约为1∶80 000。用ORFV野毒型感染OFTU细胞，在感染48 h后收集细胞裂解液制成SDS-PAGE样品，进行Western blot检测多抗的特异性，结果显示在相应的位置出现了特异性条带(图10)。此外，使用该抗体对ORFV122蛋白的表达规律进行了研究(图11)，发现ORFV122蛋白为早期表达蛋白，随着时间的推移表达量逐渐增加。

图10 多抗特异性检测结果 M.蛋白质Marker；1.内参β-actin；2.ORFV122蛋白

图11 不同感染病毒时间ORFV122蛋白表达量的变化情况

3 讨论

在对ORFV122蛋白进行生物学同源性分析时发现该蛋白和VACV的A51R基因所编码的蛋白有较高的同源性。通过查阅文献可知A51R基因除了为毒力基因外其编码的蛋白还和宿主细胞的微管细胞骨架相互作用，保护宿主微管细胞骨架不发生解聚，并且与宿主细胞骨架相互作用的能力是A51R的保守特性。ORFV122和VACV A51R有着较高的同源性，根据对A51R的研究来对ORFV122的功能做出假设，这就进一步为ORFV122蛋白进一步研究指明方向。

通常羊传染性脓疱病是根据病理检查和临床体征进行诊断的，但在疾病早期，由于该病和羊痘、小反刍兽疫以及口蹄疫的临床症状较为相似，所以想要准确的辨别该病十分困难。特异性抗体无论在临床诊断还是实验室研究中都有广泛的应用。制备的多克隆抗体可用于ELISA、Western blot和免疫组织学等检测方法的诊断和流行病学研究，还可以通过免疫沉淀，免疫荧光，免疫金测定和免疫组织化学检测病毒的进入和定位来研究致病机制，并开发可能的亚单位疫苗和治疗药物。

本试验结果表明，成功的制备ORFV122蛋白的多克隆抗体，通过检测多抗的效果良好。ORFV122蛋白多抗的制备为该疾病的诊断和进一步的研究奠定了基础，也为ORFV122基因的生物学特性研究提供物质基础。