腐秆菌和C/N对水稻秸秆田间堆腐效果的影响

时间：2024-05-24

尹众，王鑫，鲁梦醒，卫正宇，王时聪，马超

（农田生态保育与污染防控安徽省重点实验室，安徽农业大学资源与环境学院，合肥230036）

中国拥有大量的各种农作物秸秆，据统计2020年农作物秸秆资源产量可达8.5亿t[1]。大量的秸秆资源如果得不到合理利用，则既会造成资源浪费，也会给生态环境带来巨大压力[2]。秸秆堆腐可以快速实现农业废弃物的无害化和肥料化，实现农业有机废弃物的高效利用[3]。然而，由于运输成本逐渐增加，传统的秸秆有机肥工厂化生产模式已不能满足当前秸秆处理的需求。近些年，秸秆田间堆腐越来越受到学者们的关注[4]，而添加外源腐秆菌是加快秸秆腐解、提高堆腐效果的方法之一，但田间条件下堆肥的温度、水分等因素难以控制，造成腐秆菌腐解效率低下。因此，亟需创新秸秆田间堆腐技术，提升田间条件下秸秆堆肥的效率。

秸秆堆腐是在微生物的作用下，降解和转化有机物质的生物化学过程，微生物活动在堆腐过程中起到最主要的作用[5]。然而在自然状态下，秸秆的降解周期长，不利于降解微生物生长[6]。腐秆菌常用于加速有机废物堆肥的腐熟[7]，但作为一种新型微生物产品，其功能效应并不稳定。朱金霞等[8]研究发现接种腐秆菌有利于秸秆堆腐，但不同腐秆菌的作用效果有所差别；张秧等[9]研究发现不同腐秆菌对物料中有机物降解效果的差异性与菌剂中微生物的组成配比密不可分。因此，明确不同腐秆菌对秸秆堆腐的影响具有重要意义。

秸秆堆腐配施氮肥可以调解堆体C/N，提高秸秆腐解速率。前人研究表明，常规情况下秸秆初始C/N为25∶1，最适用于秸秆或其他农业固体废物的微生物发酵和分解[10-11]。但腐秆菌施入会改变土著微生物群落结构和功能，进而令其氮素需求发生变化[12-13]，因此最佳初始C/N可能会发生改变。此外，前人研究秸秆堆腐多在室内或厂房集中进行，田间堆腐是否适用最佳C/N 25∶1 尚不明确。因此，探明秸秆田间堆腐配施不同腐秆菌是否存在对应的最佳初始C/N十分重要。

前人研究多关注不同腐秆菌种类和不同C/N 对秸秆腐解的影响，例如：Yusef 等[14]研究发现秸秆还田条件下腐秆菌配施氮肥时秸秆初始C/N 为18∶1最有利于秸秆腐解；朱远芃等[15]研究发现氮肥和腐秆菌组合可以协同促进秸秆堆腐。但有关不同C/N下腐秆菌对秸秆堆腐的影响还缺乏深入研究，有必要探明不同腐秆菌和C/N 组合对秸秆堆腐的作用效果。

本研究采用2因子3水平交互实验设计，共计9个处理，分析秸秆堆腐过程中秸秆质量、化学组成、酶活性和细菌群落多样性的变化规律，旨在明确不同腐秆菌和C/N 组合对水稻秸秆田间堆腐效果的影响，从而为秸秆田间堆腐技术的发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于安徽省合肥市肥西县（31°30′N，117°16′E），处于北纬亚热带与暖温带过渡地区，气候温暖湿润，有明显的过渡性，年平均气温14.8～15.9 ℃，年均降水量982.6 mm，夏季降水量占全年降水量的42%，年日照时数2 035 h，无霜期在227 d以上。

1.2 试验材料

供试秸秆为在自然环境下降解1～2 周，已形成自身降解菌群的水稻秸秆，秸秆全碳374.981 g·kg-1、全氮12.93 g·kg-1、全磷0.80 g·kg-1、全钾8.93 g·kg-1。

供试腐秆菌和氮肥：根据前期室内实验腐解效果，腐秆菌选用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SQR9 和纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）MC29，SQR9 是一株分离自黄瓜根际的植物根际促生菌株，MC29 是一株从砂姜黑土中筛选得到的具有秸秆腐解能力的菌株，MC29 腐秆菌由本实验室提供，SQR9 腐秆菌由江苏省固体有机废弃物资源化高新技术研究重点实验室提供；氮肥选用尿素（N 46%）。

1.3 试验设计

试验采用2（不接菌对照：CK，腐秆菌：SQR9、MC29）×3（C/N：15∶1、25∶1、35∶1）交互设计，试验过程中进行6次采样，每次2个重复。

首先，堆制直径1 m，高1 m，重约54.6 kg 的秸秆条垛9 个。在各条垛中部分别放入预先准备的装有10 g长1 cm秸秆的200目尼龙袋12个；然后根据秸秆C、N 含量，以及目标C/N，分别添加尿素配成的溶液；尿素添加完成后，开始进行不同腐秆菌的接种处理，SQR9 和MC29 接种前先进行预培养，将培养至指数生长期的菌株用无菌水离心重悬3 次后分别稀释成1.12×109CFU·mL-1和2.07×109CFU·mL-1的菌液，分别移取一定量菌液至秸秆堆体中，使每堆秸秆含有的菌体数约为1×107CFU·kg-1；最后，对堆体进行水分调控和覆膜，在常规管理情况下堆腐120 d。

1.4 样品采集与指标测定

1.4.1 样品采集

布置试验完成后将剩余秸秆收集起来作为第0天的样品，样品待干燥后过100 目筛用于分析初始理化性质。在第3、7、15、30、60、120天采样，根据秸秆腐解率变化结果优选出第7天和第120天的样品进行化学组成、酶活性和细菌群落多样性等测定。秸秆干样于电热鼓风干燥箱中烘干，一部分用于秸秆降解率的分析，另一部分粉碎过100 目筛，用于红外光谱的测定；秸秆鲜样储存于0 ℃的冰箱，用于酶活性测定；秸秆冻样储存于-80 ℃的冰箱，用于分析细菌群落组成。

1.4.2 秸秆腐解率

每次取样时随机从堆体中选取2 个网袋，用水冲洗网袋粘附的泥浆，在75 ℃下烘干，称质量，按照以下公式计算秸秆腐解率。

式中：Rsr为秸秆腐解率，%；M0为原始秸秆干质量，g；Mt为腐解t天后的秸秆干质量，g。

1.4.3 样品养分含量测定与化学组成分析

参照《土壤农化分析》的相关方法[16]，测定样品养分含量。秸秆样品在75 ℃烘干后研磨过100目筛，秸秆碳含量采用重铬酸钾-外加热法测定；采用H2SO4-H2O2消煮法制备待测液，采用凯氏定氮法测定全氮含量，采用钼锑抗比色法测定全磷含量，采用NH4OAc-火焰光度法测定土壤速效钾含量。

采用傅里叶变换红外光谱法进行化学组成分析[17]。红外光谱采用KBr 压片后Nicolet 8700 傅里叶变换红外光谱仪（Fourier Transform Infrared Spectrometer，FTIR，美国热电公司）进行分析，波谱范围4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，透射模式扫描32 次。压片前分别取出事先烘干的KBr 300 mg 和秸秆样品3 mg，并在玛瑙研钵中充分磨细，然后放入100 ℃的烘箱内，烘干5 min左右，取出后继续研磨约30 s进行装模压片。

红外光谱的吸收峰强度之比可以间接明确各类官能团的数量之比，秸秆的2 920 cm-1与1 640 cm-1和1 050 cm-1与1 640 cm-1处的峰强度比值可以间接明确各类含碳官能团在样品中的数量比例，反映秸秆腐解程度[18]。2 920 cm-1处的吸收峰为C—H 的伸缩振动，脂肪族和脂环族；1 640 cm-1处的吸收峰为酰胺化合物及木质素中与芳香环相连的伸缩振动；1 460 cm-1处的吸收峰为木质素、脂肪族化合物的C—N 伸缩振动；1 050 cm-1处的吸收峰为纤维素和半纤维素的C—O伸缩振动及Si—O的伸缩振动。

1.4.4 秸秆细菌群落变化

参考Zhang 等[19]的提取方法，根据E.Z.N.A.®Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，美国）试剂盒说明书，提取秸秆样本中的微生物组总DNA。DNA纯度和浓度检测采用NanoDrop2000，DNA完整性检测：1%琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，100 V，电泳20 min。

细菌群落结构研究采用16S rRNA V5～V6区引物799F（上游引物）5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′和1115R（下游引物）5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′进行PCR 扩增，每个样本的扩增引物含有8个碱基标签序列用以区分样本。准备20µL 的PCR 反应体系：4µL 的5×FastPfu Buffer，2µL 的2.5 mmol·L-1dNTPs，上下游引物各0.8 µL（5 µmol·L-1），0.4 µL 的FastPfu Polymerase，以及10 ng 模板DNA。PCR 扩增实验程序如下：94 ℃下进行4 min；94 ℃下进行30 s，55 ℃下进行30 s，72 ℃下进行1 min，上述三步骤进行25个循环；最后72 ℃保持10 min。

扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，美国）试剂盒，参照说明书操作流程进行纯化。将PCR 产物用Quantus™Fluorometer 进行检测定量。按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 建库。利用Illumina 公司的NovaSeq PE250 平台测序（上海凌恩生物科技有限公司）。

1.4.5 秸秆酶活性

纤维素酶活性采用蒽酮比色法[20]，测定纤维素酶催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。

木质素过氧化物酶活性采用以天青B 为底物的测定方法[21]，木质素过氧化物酶催化天青脱甲基，通过测定在651 nm 处吸光度变化计量木质素过氧化物酶活性。

1.5 数据分析

试验数据采用Excel进行整理，秸秆腐解率、秸秆腐解度和秸秆酶活性采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）并用Duncan′s test 检验其差异显著性水平（P＜0.05），腐秆菌和C/N 及其交互作用采用双因素方差分析（Two-Way ANOVA），数据分析由SPSS 26.0 完成，图形由Origin 2018 绘制。基于Mothur v.1.30.1软件进行稀释曲线分析，以揭示多样性指数，包括Chao1 和Shannon 多样性指数。基于UniFrac 计算β 多样性距离矩阵，优势菌群相对丰度图和NMDS（Non-metric multidimensional scaling）分析图均由R语言（version 4.1.2）vegan软件包实现。

2 结果与分析

2.1 不同处理下秸秆的腐解率变化

如图1 所示，腐解到第7 天时，不同腐秆菌和C/N对秸秆腐解率无显著影响（P＞0.05）；腐解到第120 天时，不同腐秆菌和C/N 对秸秆腐解率均有显著影响（P＜0.05），但二者的交互作用不显著，MC29的促腐效果总体强于SQR9，与CK处理相比，MC29腐秆菌处理下C/N 25∶1能显著提升秸秆腐解率（P＜0.05），腐解率达到35.93%。

图1 不同处理下秸秆的腐解率变化Figure 1 Changes of straw decomposition rate under different treatments

2.2 不同处理下秸秆残余物的腐解度变化

如表1 所示，腐解到第7 天时，腐秆菌对2 920 cm-1/1 640 cm-1和1 050 cm-1/1 640 cm-1峰强度比值的影响不显著（P＞0.05），C/N 对2 920 cm-1/1 640 cm-1和1 050 cm-1/1 640 cm-1峰强度比值有显著影响（P＜0.05），二者的交互作用不显著（P＞0.05）。2 920 cm-1/1 640 cm-1峰强度比值在不同腐秆菌处理下均以C/N 25∶1 最高，1 050 cm-1/1 640 cm-1峰强度比值在CK 处理下以C/N 35∶1 最高，在SQR9 处理和MC29 处理下均以C/N 25∶1 最高。腐解到第120 天时，2 920 cm-1/1 640 cm-1和1 050 cm-1/1 640 cm-1峰强度比值在不同处理下均无显著差异（P＞0.05）。

表1 不同处理下秸秆残余物的腐解度变化Table 1 Changes of straw decomposition degree under different treatments

2.3 不同处理下秸秆的酶活性变化

如图2所示，腐解至第7天时，不同腐秆菌对纤维素酶活性有显著影响（P＜0.05），C/N 对纤维素酶活性的影响不显著（P＞0.05），二者的交互作用影响也不显著（P＞0.05）。SQR9处理下的纤维素酶活性总体高于CK 和MC29。腐解至第120 天时，不同腐秆菌和C/N对纤维素酶活性均有显著影响（P＜0.05），但二者的交互作用影响不显著（P＞0.05），CK和MC29处理下的纤维素酶活性高于SQR9 处理，C/N 25∶1 处理下的纤维素酶活性高于C/N 15∶1处理，C/N 35∶1处理下的纤维素酶活性与其余两种C/N 处理相比无显著差异（P＞0.05）。

图2 水稻秸秆堆腐过程中纤维素酶和木质素过氧化物酶活性的变化Figure 2 Changes of cellulase and lignin peroxidase activity during rice straw-composting

腐解至第7 天时，不同腐秆菌和C/N 对木质素过氧化物酶活性无显著影响（P＞0.05），二者的交互作用影响也不显著（P＞0.05）。腐解至第120 天时，不同腐秆菌对木质素过氧化物酶活性有显著影响（P＜0.05），C/N 对纤维素酶活性的影响不显著（P＞0.05），二者的交互作用影响也不显著（P＞0.05），MC29 处理下的木质素过氧化物酶活性高于CK处理，SQR9处理下的木质素过氧化物酶活性与其余两种腐秆菌处理相比无显著差异（P＞0.05）。

2.4 不同处理下秸秆的细菌群落变化

如表2 所示，腐解至第7 天时，腐秆菌和C/N 对Chao1 指数和Shannon 数值均无显著影响（P＞0.05），二者的交互作用影响也不显著（P＞0.05）。腐解至第120 天时，C/N 对Chao1 指数和Shannon 指数有显著影响（P＜0.05），腐秆菌对Chao1 指数和Shannon 指数的影响不显著（P＞0.05），二者的交互作用影响也不显著（P＞0.05），在CK 处理下，Chao1 指数和Shannon 指数差异不显著，在SQR9 和MC29 处理下，C/N 对Chao1指数和Shannon 指数有显著影响，Chao1 指数和Shannon 指数总体呈现出随C/N 升高而上升的趋势，氮素添加量过高会降低细菌群落丰富度和多样性。

表2 不同处理下秸秆的细菌群落丰富度和多样性变化Table 2 Changes of straw bacteria richness and diversity under different treatments

如图3 所示，腐解至第7 天时，门水平上，不同处理下Proteobacteria（变形菌门）相对丰度均为最高，为优势细菌类群，其次是Bacteroides（拟杆菌门）和Actinobacteria（放线菌门）；纲水平上，不同处理下Gammaproteobacteria（γ-变形菌纲）相对丰度均为最高，为优势细菌类群，其次是Actinobacteria（放线菌纲）、Alphaproteobacteria（α-变形菌纲）和Clostridia（梭菌纲）。但随着腐解时间的延长，腐解到第120 天时，门水平上，Proteobacteria 的相对丰度减小，Bacteroidota和Firmicutes（厚壁菌门）相对丰度升高，Proteobacteria、Bacteroides、Actinobacteria 和Firmicutes 4 个菌门相对丰度较高，Patescibacteria、Myxococcota、Bdellovibrionota、Gemmatimonadota 和Acidobacteriota 等细菌菌门在各样品中相对丰度都较低；纲水平上，Gammaproteobacteria 相对丰度减小，Bacteroidia（拟杆菌纲）和Bacilli（芽孢杆菌纲）等菌纲相对丰度升高。

图3 不同处理下细菌在门和纲分类水平上的优势菌群相对丰度图Figure 3 Relative abundance of bacterial phyla and bacterial class under different treatments

如图4所示，腐解至第7天时，各样本点分布较为集中，ANOSIM 分析结果显示不同腐秆菌和C/N 对细菌群落相似度无显著影响（P＞0.01）；腐解至第120 天时，不同处理下各样本点较为分散，ANOSIM 分析结果显示C/N 对细菌群落相似度有显著影响（P＜0.01）。如表3 所示，腐解至第120 天时，PERMANOVA 分析结果显示C/N 15∶1、C/N 25∶1、C/N 35∶1 处理之间细菌群落结构均存在显著差异（P＜0.05），表明腐解至第120天时，不同C/N会显著影响细菌群落结构。

表3 堆腐第120天时不同C/N处理间的细菌群落差异（PERMANOVA）Table 3 PERMANOVA test indicating the bacteria community differences between groups of different C/N after 120 days of composting

图4 不同处理下堆腐第7天和第120天的细菌群落NMDS分析图Figure 4 The NMDS analysis of bacteria community after 7 days and 120 days of composting under different treatments

3 讨论

本研究发现不同C/N 会显著影响第7 天的秸秆化学组成变化，不同C/N 和腐秆菌会显著影响第120天的秸秆腐解率变化。堆腐第7 天时，C/N 对秸秆的腐解度有显著影响，SQR9 和MC29 处理下2 920 cm-1/1 640 cm-1和1 050 cm-1/1 640 cm-1的峰强度比值均以C/N 25∶1最高，表明C/N 25∶1条件下，脂肪类物质、多糖物质相较于芳香类物质有所增加，这与孙向平等[22]的研究结果一致。在本研究中，MC29 和SQR9 处理下均为C/N 25∶1 秸秆腐解度最高。这可能是因为：一方面，氮能够与秸秆中的多酚、木质素等形成复杂化合物，使易于分解此类化合物的微生物成为优势种群；另一方面，田间堆腐时，调节堆体C/N 促进了秸秆中木质素的变性，从而促进了纤维木质素的分解[23]。

在本研究中，堆腐前期变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门为优势菌门，其丰度超过90%，这与Tortosa 等[24]的研究结果一致。前人研究表明，变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门是在木质纤维素堆肥中主导的细菌门类[25]，这4 种菌门对腐解过程中有机物的分解起主要作用。其中，变形菌门具有产漆酶能力，在放线菌门和芽单胞菌门的协同作用下进行木质素的加工和代谢[26]。拟杆菌门是降解木质素的功能菌，具有降解大分子物质的能力，包括纤维素、淀粉和几丁质等[27]。而放线菌门具有良好的纤维素酶活性，放线菌门下的诺卡氏菌（Nocardioeae）、链霉菌科（Streptomycetaceae）等在秸秆木质纤维素分解过程中起着非常重要的作用[28]。值得一提的是，本研究发现堆腐第7 天时不同处理下秸秆腐解率无显著差异，而王志方等[29]研究发现添加氮肥后，腐解前期的降解率下降，这与本研究结果不一致，但是Grandy 等[30]研究也指出秸秆腐解率不受施氮量的影响。造成本研究堆腐前期不同处理下秸秆腐解率无显著差异的原因可能是试验在冬季田间进行且未提供通气，腐秆菌生长速度较慢，有机物质降解效率较低，秸秆腐解需要更长的时间来完成，腐秆菌和氮肥需要充足的时间才能显著增加秸秆的质量损失。

本研究显示，堆腐第120天时，虽然腐秆菌和C/N的交互作用影响不显著，但是腐秆菌和C/N 对腐解率均有显著影响。另外，本研究还发现MC29 腐秆菌处理下C/N 25∶1 的腐解率高于其余组合，这可能与C/N 25∶1 条件下纤维素酶、木质素过氧化物酶活性的提高有关。纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶、纤维二糖苷酶和木聚糖酶等多种酶，通过加快秸秆中多糖以及可溶性碳等组分的分解，可提高秸秆腐解率[31]。牛俊玲等[32]比较了不同C/N 堆肥过程中纤维素酶和蔗糖酶的活性变化发现，C/N 25∶1 时纤维素酶活性最高，说明C/N 25∶1 时更有利于纤维素的分解。Guo 等[33]也发现，充足的氮肥投入可以增强与秸秆腐解相关的纤维素酶活性。木质素过氧化物酶是木质素生物降解过程中的主要木质素降解酶类，可在木质素聚合物内形成自由基，导致键稳定性变差从而破坏木质素大分子[34]，降低秸秆残余物的木质素含量。Yang 等[35]的研究也表明堆肥过程中C/N 25∶1 最有利于刺激木质素过氧化物酶活性，进而促进木质素纤维素的降解。

堆腐第120 天时，不同处理下细菌群落的Chao1指数和Shannon 指数均呈随施氮量上升而下降的趋势，此结果与刘倩倩[36]的研究结果一致。前人研究表明，高施氮处理会降低微生物生物量、多样性和呼吸速率[37]，而微生物形成自身细胞通常需要吸收1 份氮和5 份碳，同时消耗作为能源的20 份碳，所以25∶1 是大部分微生物进行生命活动的最佳C/N，即C/N 越接近于25∶1，越有利于有机质的充分转化[38]，C/N 25∶1可能更有利于MC29 腐秆菌定殖，微生物群落也向着更加有利于秸秆腐解的方向发展。另外，门和纲分类水平上的优势菌群的相对丰度也随着堆腐进程发生了一定的变化。变形菌门和变形菌门下的γ-变形菌纲的相对丰度下降，这可能是因为变形菌门是富营养型细菌，在丰富的营养环境中生长较快，腐解后期，堆体中的营养物质减少，变形菌门生长受到抑制[39]。拟杆菌门和拟杆菌门下的拟杆菌纲的相对丰度上升可能是因为拟杆菌门细菌与DNA、脂类和蛋白质等有机物质的转换密切相关[40]，拟杆菌门下的鞘脂杆菌纲、鞘脂杆菌目类群的最大作用就是降解纤维素。因此在堆腐过程中，拟杆菌门的相对丰度上升，从而秸秆中的纤维素被降解。厚壁菌门和芽孢杆菌纲在堆腐过程中相对丰度出现明显上升，这可能是因为厚壁菌门能够产生内生孢子，具有较高的耐受性，能够生存在不适宜的环境中[41-43]，且芽孢杆菌纲下的芽孢杆菌属能够降解多种大分子化合物，如淀粉、纤维素等多糖、蛋白质等[44-45]，因此其可协助拟杆菌门降解秸秆中富含的纤维素大分子。另外，本研究发现堆腐后期不同处理下秸秆的化学组成无显著差异，这与王时聪[46]的研究结果一致。造成这种现象的原因可能是秸秆堆腐时微生物会优先分解可溶性糖类、纤维素等，堆腐后期不同处理下秸秆中主要是难分解的物质，如木质素、芳香类物质等[47]。

值得注意的是，本文对不同处理下秸秆的微生物群落动态变化的研究只考虑了细菌，而根据前人研究，真菌也在秸秆堆腐过程中起到了不可忽视的作用，故后续可对真菌群落的动态变化进行研究，以更加全面地揭示秸秆微生物群落的变化。除此之外，氮肥形态的影响也是值得探究的一个方面，未来可以从不同氮肥形态的角度对秸秆堆腐进行进一步研究。