外源NO对铝胁迫下西瓜幼苗生长及生理特性的影响

时间：2024-05-24

肖家昶，郑开敏，马俊英，郑阳霞

（四川农业大学园艺学院，成都 611130）

铝是地壳和土壤中含量最丰富的金属元素，约占地壳总矿质元素的7%。在正常土壤中，铝通常以对植物生长发育毒害较小的三水铝矿或无害的硅铝酸盐等沉淀物的形式存在[1]。但在酸性土壤中（pH＜5），铝从这些不溶物中释放出来形成对植物生长发育有较强毒性的Al3+，造成酸铝毒害，不利于植物的生长。铝毒最明显的特征是抑制植物根尖生长，影响植物对水分及营养物质的吸收，从而导致植物生长受到抑制及农作物减产[2]。我国南方地区土壤偏酸性，因此酸性土壤中的铝毒是限制当地作物生产的主要因素之一[3]。

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.et Nakai]属于葫芦科植物，是我国重要的经济作物之一。我国是西瓜生产第一大国，其栽培面积、总产量和消费量均居世界首位[4]。土壤酸化后导致活性铝的含量增加，这是引起西瓜连作障碍的原因之一，作为一种铝敏感瓜类作物，土壤的铝胁迫抑制了西瓜的生长发育，也严重影响西瓜的产量和品质[5]。

一氧化氮（NO）是在植物体内以自由基形态存在的气体小分子信号物质，被认为是一种新型的“气体传递素”，能够调节植物生长发育，在植物受到胁迫时传导信息以提高植物抗逆能力[6-7]。NO 直接参与植物生长发育和胁迫反应的调节，目前研究表明：几乎所有的胁迫都能使植物激发活性氧（ROS）的产生，NO 能与各种氧的形式发生反应，减少体内ROS 的积累[8]。NO 还可通过调节植物体内的抗氧化酶类改善抗氧化酶的活性，清除体内产生的活性氧，降低膜质过氧化产物丙二醛的含量。除此以外，NO 可以延缓胁迫下叶片叶绿素的降解，对光合作用起到间接的保护作用。一般可以将NO 功能归纳为两个方面：一方面通过提高渗透调节物质脯氨酸以及抗氧化能力来增强植物耐盐性，另一方面NO 可以作为一种信号分子通过提高质膜H+-ATPase 活性，增强K+/Na+值来抵抗逆境胁迫[9-10]。目前已有研究表明NO 在大豆[11]、土沉香[12]、烟草[13]、桉树[14]等作物缓解铝胁迫上有明显作用。然而目前NO 对西瓜铝胁迫的缓解作用还不清楚，本试验通过NO 供体硝普钠（SNP）处理西瓜幼苗，探讨铝胁迫下外源NO 对铝毒的调节作用，以期为进一步探讨缓解西瓜铝胁迫提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试西瓜品种为市售的“早佳84-24”。供试试剂为十八水合硫酸铝[Al2（SO4）3·18H2O，分析纯]、硝普钠（SNP-NO 供体，C5H4FeN6Na2O3，分析纯）、亚硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME-NOS 抑制剂，C7H15N5O4·HCl，分析纯）。

1.2 材料培养

选取大小均匀、健康饱满的西瓜种子，55 ℃温水浸种15 min，冷却至室温后继续浸种6 h，放入恒温箱中30 ℃催芽。种子露白后播种于装有珍珠岩、蛭石、有机肥（珍珠岩∶蛭石∶有机肥的质量比为4∶3∶1）的穴盘中，待幼苗长至两叶一心时将其移栽至10 cm×10 cm 营养钵中，每3 d 浇灌一次1/3 Hoagland 营养液。试验地为四川农业大学园艺学院植物工厂，温度为25 ℃，光照强度5 000 lx，相对湿度75%，光-暗周期为16 h-8 h。

1.3 材料处理

采用Al2（SO4）3模拟铝胁迫试验，以SNP 为外源NO供体，待西瓜幼苗三叶一心时，开始向根周围施用50 mL 不同浓度处理液（以1/2 Hoagland 营养液作为溶剂，分别添加浓度为1 200µmol·L-1的硫酸铝和不同浓度的SNP 以及L-NAME）。共设7 个处理，每个处理3 次重复，每个重复24 株幼苗。每3 d 浇灌一次处理液，处理液的pH用HCl或NaOH 调节到4.5，保证酸性条件，具体试验设计见表1。处理中硫酸铝浓度为前期预试验筛选所得，NO 浓度梯度选择参考NABI等[10]。

表1 试验设计Table1 Experimental design

1.4 测定方法

1.4.1 生长指标

处理15 d 后，每处理随机选取5 株幼苗进行生长指标测定，根长以及株高用直尺进行测量（分界点为根茎的节点位置），地上部和地下部的鲜质量清洗干净以后用纸巾吸干水分后放在电子天平进行称量记录，茎粗用游标卡尺进行测量。

1.4.2 生理指标

处理15 d 后，每个处理随机选取15 株幼苗，挑选完全展开的成熟叶片进行测定，测定的指标有超氧化物歧化酶（SOD）活性（均以鲜质量计，下同）、过氧化物酶（POD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、叶绿素含量。各项指标均参照李合生[15]和高俊凤[16]的方法稍有改动。

1.4.3 叶绿素荧光参数及光合参数

处理10 d 后，进行叶绿素荧光及光合参数的测定。使用叶绿素荧光仪（PAM2500）测定西瓜幼苗第2 片真叶的叶绿素荧光参数，将西瓜幼苗叶片放在暗室暗适应30 min后测定漫速荧光诱导曲线，仪器自动记录下初始荧光（F0）、最大荧光（Fm）、最大光化学效率（Fv/Fm）、非光化学淬灭系数（qN）、光化学淬灭系数（qP）、电子传递速率（ETR）等荧光参数。

使用Li-6400便携式光合仪测定西瓜第2片真叶的光合参数，仪器自动记录净光合速率（以CO2计）、气孔导度（以H2O 计）、胞间CO2浓度（以CO2计）、蒸腾速率（以H2O 计）等光合指标。测定光强为1 000 µmol·m-2·s-1，叶温为25 ℃，CO2浓度为400 µmol·mol-1，相对湿度为75%。

1.4.4 矿质元素含量测定

将植物叶片烘干粉碎，进行元素测定。钾、钙、镁、铁、锌、铜、铝元素含量测定：称取0.5 g 样品置于锥形瓶中，加入4 mL 高氯酸和16 mL 硝酸，用保鲜膜封口过夜，在电热板上加热消煮定容后，用原子吸收分光光度计测定。磷元素测定采用钒钼黄比色法[17]。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2016 软件进行数据整理，使用SPSS 22.0 进行统计分析，使用Origin 2019b 进行作图，图表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NO对铝胁迫下西瓜生长状况的影响

由表2 可知，CKAl 处理下西瓜生长明显受到抑制，其地上及地下部鲜质量、根长和根系活力与CK相比都有显著降低。而在添加外源NO 后，西瓜受铝的抑制作用得到缓解，与CKAl 相比，N50 与N100 的地上部鲜质量、地下部鲜质量、株高、根长、茎粗和根系活力均明显增加，N500 处理下则表现为抑制西瓜生长发育。与N100相比，N-L 处理各项指标均降低，说明50～100µmol·L-1NO 可以缓解西瓜的铝胁迫，促进幼苗生长。

表2 NO对铝胁迫下西瓜生长状况的影响Table2 Effects of NO on growth condition of watermelon under aluminum stress

2.2 不同浓度NO对铝胁迫下西瓜抗氧化系统的影响

由图1 可知，与CK 相比，CKAl 的SOD、POD、CAT 活性均显著降低，MDA 含量显著上升。与CKAl相比，外源NO 可以提高西瓜幼苗抗氧化酶活性，降低MDA 含量。在N100 处理中，SOD 与POD 酶活性分别比CKAl 高236.16%、19.86%，MDA 含量降低了22.46%。CAT 酶活性在N50 处理时达到最高，比CKAl 高33.82%。与N100 相比，N-L 处理下SOD、POD、CAT 酶活性分别降低41.80%、9.72%、39.62%，MDA 含量上升了19.12%。说明低浓度NO（50～200µmol·L-1）对西瓜叶片抗氧化酶的生成起积极作用，并且减少MDA 含量的累积，但高浓度NO（500 µmol·L-1）会抑制抗氧化酶的合成或加速抗氧化酶分解。

2.3 不同浓度NO对铝胁迫下西瓜渗透调节物质的影响

由图2 可知，与CK 相比，CKAl 的可溶性糖与脯氨酸含量显著上升，可溶性蛋白含量没有显著差异。外施NO 后西瓜叶片中可溶性糖含量随着NO 浓度升高不断增加，除N50 处理外，与CKAl 相比无显著差异。脯氨酸含量随着NO 浓度的升高表现出低浓度（50～100µmol·L-1）促进而高浓度（500µmol·L-1）抑制趋势，可溶性蛋白含量处理间差异不显著。与N100处理相比，N-L处理中西瓜叶片可溶性糖含量上升了30.69%，脯氨酸含量下降了68.65%，可溶性蛋白含量无显著变化。由此说明NO 主要通过影响脯氨酸与可溶性糖含量来缓解铝胁迫下西瓜叶片的铝毒损伤。

2.4 不同浓度NO对铝胁迫下西瓜光合特性的影响

由表3 可知，处理10 d 后，与CK 相比，CKAl 西瓜幼苗的叶绿素a 含量、叶绿素b 含量、净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）均明显下降。外施低浓度NO（50、100、200µmol·L-1）均促进了西瓜幼苗叶绿素a含量、叶绿素b含量、Pn、Gs、Ci、Tr的上升。与CKAl相比，N50处理下叶绿素a含量、Pn、Gs、Ci、Tr分别上升了67.16%、126.15%、250.00%、21.03%、152.03%。而N500处理下西瓜幼苗的叶绿素a含量、叶绿素b 含量、Pn、Gs、Ci、Tr 则显著降低。N-L 处理下西瓜叶片叶绿素a 含量、叶绿素b 含量、Pn、Gs、Ci、Tr 分别比N100 下降了28.44%、43.48%、45.42%、60.00%、13.30%、50.91%。由此可见，外源NO 有助于提高铝胁迫下西瓜幼苗的净光合速率，从而增强光合作用能力。

表3 NO对铝胁迫下西瓜叶绿素含量及光合参数的影响Table3 Effects of NO on chlorophyll content and photosynthetic parameters of watermelon under aluminum stress

由表4 可以看出，处理10 d 后，CKAl 西瓜叶片中初始荧光（F0）值、最大荧光（Fm）值、PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光合量子产量（ETR）、光化学淬灭系数（qP）均明显降低，与CK 相比分别下降了12.68%、15.18%、4.94%、25.40%、9.30%，非光化学淬灭系数（qN）上升了63.89%。在施加外源NO 后，西瓜叶片Fv/Fm、ETR、qP 上升，qN 下降。N50 处理下Fv/Fm、ETR 和qP 比例显著上升，分别较CKAl 上升了6.49%、37.47%、11.54%，而qN 较CKAl 则显著下降了45.76%，表明西瓜叶片用于光化学反应的光能比例上升。与N100 相比，N-L 处理中西瓜幼苗Fv/Fm、ETR、qP 下降，而qN 上升。由此可见，铝胁迫显著抑制了西瓜光系统Ⅱ电子传递速率，降低了西瓜的光合能力。施加NO 可以增强西瓜叶片的相对电子传递速率，减少光系统Ⅱ用于耗散为热量的光能比例，从而提高西瓜幼苗的净光合速率，这与光合参数的结果相吻合。

表4 NO对铝胁迫下西瓜叶片叶绿素荧光参数的影响Table4 Effects of NO on chlorophyll fluorescence parameters of watermelon leaves under aluminum stress

2.5 不同浓度NO对铝胁迫下西瓜营养元素的影响

由表5 可知，与CK 相比，CKAl 中西瓜叶片的钾、钙、镁元素含量不同程度减少，而叶片铁、铜、锌、铝、磷元素含量升高，其中铝元素的变化最大，与CK 相比，CKAl 叶片铝含量上升了192.67%。经不同浓度的NO 处理后，西瓜叶片矿质元素的含量会随着处理浓度的改变而改变，并且不同的元素有不同的变化趋势。N50 处理西瓜叶片中钾、钙、镁、锌、磷含量分别比CKAl 高了4.67%、2.41%、0.03%、8.11%、21.41%，而铁、铜、铝含量分别比CKAl 降低了28.73%、12.50%、26.83%。与N100 相比，N-L 处理叶片中钾、钙、镁、铁、锌、磷元素吸收均受到抑制，而铜、铝元素吸收得到促进，说明NO 会影响铝胁迫下西瓜叶片对各营养元素的积累，减少铝元素在叶片中的累积。

表5 NO对铝胁迫下西瓜叶片矿质元素的影响（mg·g-1）Table5 Effects of NO on mineral elements in watermelon leaves under aluminum stress（mg·g-1）

3 讨论

铝在土壤中大量富集后，会对植物的生长发育产生不利影响，进而影响品质及产量。本试验中铝胁迫处理显著抑制西瓜根系的伸长，同时对西瓜的生长有显著的抑制作用，这与前人描述铝胁迫下植物生长受到抑制的结论一致[18-19]。自然状态下，植物在其生存环境中可产生一定量的NO。为了消除内源NO 对试验结果的干扰，揭示铝胁迫下外源NO 对西瓜抑制作用的缓解效应，本试验设置了NOS 抑制剂L-NAME处理。结果表明（表2），添加外源NO 能够明显促进铝胁迫下西瓜幼苗的株高、根长和鲜质量提高，说明通过外源NO 处理，可以缓解铝胁迫对西瓜幼苗生长的抑制作用。

铝胁迫下植物体内会产生大量活性氧并积累，如果活性氧不能及时被清除，则会引起细胞受损，从而影响植物生理状态。植物膜脂过氧化过程中还会产生丙二醛、脯氨酸以及一些渗透调节物质，胁迫程度越高，其含量越高。由此植物在进化过程中形成了一套抵御外界不良环境所形成的活性氧清除系统。SOD、POD、CAT 等抗氧化酶能够有效地清除活性氧[20]。其中SOD专一性地催化O-2·发生歧化反应生成O2和H2O2，H2O2可以被POD 和CAT 清除[21]。大量的研究表明，NO 可通过提高渗透调节物质脯氨酸以及抗氧化能力来增强植物抗逆性，同时显著降低MDA含量，缓解逆境造成的损伤[22]。本试验中（图1～图2），添加外源NO 增加了铝胁迫下西瓜幼苗的SOD、POD、CAT 酶活性及脯氨酸含量，并降低了MDA 积累，减少了质膜过氧化的损伤。当NO 浓度为50µmol·L-1时，脯氨酸含量上升了126.57%，在维持渗透平衡中起关键作用。西瓜叶片通过脯氨酸与可溶性糖、可溶性蛋白的共同积累来调节细胞渗透势，维持细胞间水分平衡，而加入NOS 抑制剂L-NAME 后脯氨酸含量下降，可以得出外源NO 能够缓解铝胁迫对叶片膜系统造成的伤害。

光合色素参与植物光能的吸收、传递和转化，是反映光合能力的一个重要指标。当植物长期处于不良环境中，会出现叶绿素含量降低、光合作用速率下降等特征[23]，光合作用是植物进行碳同化、积累有机物、为植物生长发育提供能量的过程[24]。OHKL 等[25]的研究发现，随着铝胁迫浓度的增大，小麦（C3 作物）和大豆（C4 作物）中的叶绿体含量都显著减少，光合效率也明显下降。一般认为，光合速率和气孔导度存在一定的线性关系，即光合速率增强，气孔导度增大，而在光合作用受阻碍时，气孔导度减小，导致进入叶片内的CO2减少[26]。在本试验中（表3），高铝胁迫下（1 200 µmol·L-1）西瓜叶片叶绿素含量减少，Pn、Gs、Tr、Ci 均明显降低，说明铝胁迫引起的生物量下降与叶片净光合速率下降直接相关。且西瓜叶片中Pn 与Gs、Ci 同时下降，进一步说明西瓜叶片叶肉细胞光合能力降低的主导因素为铝胁迫抑制了西瓜叶片气孔的开度，导致细胞间隙CO2浓度降低（气孔限制）。施加低浓度NO（50、100、200µmol·L-1）可以促进西瓜叶片叶绿素含量及Pn、Gs、Ci、Tr 明显上升，表明NO 可以促进西瓜叶片中叶绿素合成，从而促进西瓜叶片对光能的吸收和利用，并通过提高叶片气孔张开程度促进西瓜净光合速率的提高，最终促进西瓜幼苗的生长，证明外源NO 可以逆转铝胁迫下西瓜气孔限制引起的光合速率的降低。除此以外，外施NO 也能够维持大白菜、八宝景天等在胁迫下具有较高的光化学活性，保证光合作用的正常进行[27-28]。

叶绿素荧光参数作为光合作用的经典测量方法，在植物叶片光合作用过程中对光能的吸收、传递、耗散、分配等具有独特的作用[29]。逆境胁迫下，Fv/Fm降低是PSⅡ反应中心受损、发生光抑制的显著特征。其次，叶绿素荧光是植物体内光合量子效率调节的一个重要方面，它分为光化学淬灭和非光化学淬灭两类。光化学淬灭系数（qP）反映了PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学传递的份额，非光化学淬灭系数（qN）反映了PSⅡ天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的部分[30]。研究表明，外源NO 也可通过保护性热耗散机制缓解盐胁迫条件下山葡萄幼苗的光抑制，致使山葡萄叶片的PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、PSⅡ实际光化学效率（ΦPSⅡ）、光化学淬灭系数（qP）和保护性热耗散（ΦNPQ）均升高，非调节性能量耗散（ΦNO）显著下降[31]。本试验中（表4），铝胁迫下西瓜叶片F0、Fm、Fv/Fm、qP 均显著降低，说明细胞膜系统受到破坏，PSⅡ反应中心受到破坏或失活，光合电子传递受阻，使西瓜叶片用于非光化学淬灭的比例较高，用于光化学反应的能量减少，由此可以解释铝胁迫下西瓜叶片光能利用转化效率降低以及光合能力减弱。在添加适当浓度（50µmol·L-1）NO 后可以提高西瓜叶片的潜在光能转化效率，增加光系统Ⅱ的相对电子传递速率，使光系统Ⅱ中用于光化学反应的份额增加，减少能量以热形式耗散。说明外施NO 对铝胁迫下西瓜电子传递效率起积极作用，有助于提高西瓜光合能力。

铝毒害严重影响作物的生长和产量，其中重要的因素就是影响植物的根系矿质元素的吸收和运输，各种生理生化过程受到抑制，从而导致生产力下降，品质降低。本试验中（表5），铝胁迫抑制了西瓜叶片钾、钙、镁元素积累，而钾和钙对植物光合作用气孔开闭和同化物的运输具有调节作用，镁直接参与叶绿体中叶绿素、蛋白质的构成，可以推断出钾、钙、镁元素含量降低是西瓜光合能力减弱的原因之一。在茶树[32]、泡桐幼苗[33]等研究中也发现了铝胁迫抑制了植株对营养元素的累积，这与前人研究结果一致。其机制可能与大量铝离子与阳离子竞争结合位点，导致离子通道阻塞、根系呼吸作用降低有关[34]。在添加NO为50µmol·L-1时，促进了叶片中钾、钙、镁、铁、锌、磷元素含量的上升，显著抑制了铝元素的累积，其中铁是电子传递体重要成分，锌参与叶绿素的合成以及是SOD 的重要活化剂，磷元素组成的ATP、FMN、NAD+、NADP+直接参与光合呼吸代谢。由此可以说明NO 能够有效缓解铝诱导的膜结构破坏和光合呼吸代谢生理紊乱等不利影响，促进西瓜幼苗光合同化及能量转换。而当NO 浓度为500 µmol·L-1时，这种缓解作用消失，甚至抑制了西瓜叶片对营养元素的累积，分析其原因可能与本试验中高浓度的NO 导致西瓜叶片氧化系统遭受破坏和细胞受到伤害有关[35]，具体原因有待进一步探讨。