环丙沙星对睾丸酮丛毛单胞菌CT1降解4-氯硝基苯作用的影响

时间：2024-05-24

刘勇豪，徐淼，吴铭，罗俊，尚佳歧，郭立泉，2*

（1.秸秆生物学与利用教育部重点实验室，吉林农业大学生命科学学院，长春 130118；2.国家环境保护湿地生态与植被恢复重点实验室，东北师范大学环境学院，长春 130024）

4-氯硝基苯（4-chloro-1-nitrobenzene，4-CNB）是一种常见的有机氯中间体，主要用于合成材料、制备染料、药品（非那西丁、扑热息痛）、农药（除草醚）等。当前，环境中的4-CNB 污染问题备受各国政府和学者关注，被喻为严重威胁人类生命安全的一个定时炸弹[1]。大量排放到环境中的4-CNB 会引起神经衰弱、溶血性贫血、肝损害、败血症等疾病甚至死亡，严重威胁人类和动物的安全与健康。在4-CNB的修复技术和方法中，生物降解技术具有安全、经济、环境友好等优点[2]。目前，研究人员已经分离得到了多株4-CNB 降解菌株，如睾丸酮假单胞菌（Comamonassp.）、恶臭假单胞菌（Pseudomonassp.）、红假单胞菌（Rhodosporidiumsp.）和醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）等[3-6]。这些研究为环境中4-CNB的生物降解提供了重要的方法和手段。

环境污染中抗生素往往与4-CNB 共存。抗生素的污染状况、环境行为、生态效应等方面均是近年来环境领域的研究热点之一。研究结果显示，在全国范围内的河流、湖泊、水库、近岸及海洋以及其沉积物中均已检出抗生素。其中，以白洋淀湖污染最为严重，湖水中氟喹诺酮类抗生素的含量最高可达3 093 ng·L-1，其沉积物中抗生素污染物的含量高达1 475 ng·g-1[7]。在长江口、东海、南海及各海岸线也相继检出了抗生素，包括四环素类抗生素、大环内脂类抗生素、氨基糖苷类抗生素、β-内酰胺类抗生素、磺胺类抗生素，这几类抗生素为环境中最常检出的几类抗生素，其典型浓度水平为ng·L-1至µg·L-1[8-11]。经证实，残留在环境中的抗生素将影响微生物的生物量、群落结构和活性，并诱导微生物产生抗性基因[12]。

抗菌性是抗生素的本质属性。抗生素可对4-CNB 降解菌这类环境有益菌产生生态效应，进而影响降解菌对环境中4-CNB 的降解性能。李祎毅等[13]通过红霉素对细菌GY2B 的毒性试验，研究了菌体细胞在红霉素作用下的生理、毒理指标以及后效应期间菌体的变化。研究发现，GY2B 对红霉素的最高耐受（99.9%死亡率）浓度为25µg·mL-1，长期接触低于25µg·mL-1的红霉素可降低GY2B 对药物的敏感性，使其产生耐药性。贾慧等[14]通过对红霉素对多环芳烃降解菌的毒性及降解性能影响的研究发现，多环芳烃生物降解菌降解性能与红霉素的浓度有关。刘静娴等[15]通过对抗生素对雌二醇降解菌JX-2 降解性能的研究发现：当各抗生素浓度为10.0 mg·L-1时，混合抗生素显著抑制了菌株对E2 的降解。目前针对4-CNB 生物降解的研究多集中在菌株筛选、鉴定、驯化和降解特性等方面，而围绕抗生素对其影响方面报道较少，而且关于抗生素对于环境污染物的微生物降解的影响因素的相关研究也并不全面，缺少有关抗生素对细胞活性及酶活性影响的研究。因此，研究抗生素对4-CNB 微生物降解的影响，对微生物降解清洁技术的应用和保障人类健康安全具有重要的意义。

本文比较了9种4-CNB降解菌株的降解效率，筛选出降解效率最高的菌株——睾丸酮丛毛单胞菌CT1（Comamona stestosteroniATCC11996）。通过药物敏感性试验，研究了18 种环境中常见抗生素对CT1的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。采用4-CNB-抗生素联合培养法，探讨了环境中检出率最高的氟喹诺酮类抗生素——环丙沙星对CT1 菌株生长情况、细胞活性、总超氧化物歧化酶（SOD）活性以及不同浓度抗生素下对菌株降解能力的影响，以期通过研究抗生素对4-CNB 降解性能的影响和所产生的生态效应，为环境中4-CNB 的生物降解和应用提供技术和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonastestosteroni）CT1和KF-1、弧菌（Vibrio）H5、布丘氏菌（Buttiauxella）S19-1、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）PS、红球菌（Rhodococcussp.）P14、施氏假单胞菌（Pseudomonassp.）JP1、假单胞菌（Pseudomonassp.）LY1 和醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）LM1。

1.2 主要试剂及培养基

抗生素：盐酸四环素、红霉素、硫酸庆大霉素、链霉素硫酸盐、氨苄青霉素钠、氯霉素、卡那霉素硫酸盐、羧苄青霉素钠、甲硝唑、盐酸环丙沙星、头孢氨苄、盐酸土霉素、盐酸金霉素、阿莫西林、盐酸克林霉素、磺胺甲恶唑、磺胺二甲恶唑和强力霉素，均购自上海瑞华制药有限公司。

抗生素配制：所有抗生素溶液均为单标，使用5 mL容量瓶进行配制。红霉素、氯霉素分别配制成浓度为5 120µg·mL-1的乙醇溶液，其余抗生素为5 120µg·mL-1的水溶液，即为抗生素母液。试验前均使用无菌水稀释成浓度为1 280µg·mL-1的溶液，4 ℃储存备用。

色谱纯4-CNB（美国Sigma-Aldrich公司）。

4-CNB 溶液的配制：使用无水乙醇配制成10 mmol·L-1的4-CNB 母液，4 ℃储存备用。试验时，吸取20µL 4-CNB 母液，加入2 mL LB 培养基中，即4-CNB的终浓度为0.1 mmol·L-1。

分析纯氯仿（北京化工厂）；色谱纯甲醇（Fisher Scientific 公司）；CCK-8 试剂（Bio-sharp 公司）；SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

LB 培养基、MH 培养基（青岛海博生物技术有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 4-CNB提取方法

培养液中的4-CNB 采用氯仿进行提取，制备的样品分别加入500 µL 氯仿进行萃取，在摇床上振荡20 min，然后4 000 r·min-1离心10 min，吸取下相400µL，再13 000 r·min-1离心10 min，取下相300 µL，室温下真空干燥。

1.3.2 4-CNB检测方法

采用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）（Waters e2695）检测4-CNB 的含量。检测器：UV（2988 Water Detector）。色谱柱：C18柱（粒径5 µm，4.6 mm×150 mm）。液相色谱条件为流动相：甲醇∶水=60∶40（V∶V）；流速：0.7 mL·min-1；检测波长：λ=275 nm；进样量：5 µL；柱温：25 ℃。真空干燥后的样品加入40µL 甲醇复溶后进行检测。

1.3.3 不同菌株对4-CNB的生物降解

将1.1 中的菌株分别活化后，再将处于对数生长期的细菌悬液用LB 液体培养基调整至OD600nm=0.1，分别加入终浓度为0.1 mmol·L-14-CNB 标准品，置于27 ℃、180 r·min-1恒温摇床中培养9 h，按1.3.1方法提取培养液中的4-CNB，HPLC 分别检测4-CNB 降解前后的含量，计算得到4-CNB 的降解效率（每组样品设置3组平行）。

1.3.4 菌株MIC的测定

菌株对抗生素的MIC：指在体外培养细菌18～24 h后，能够抑制培养基内细菌生长的最低药物浓度[16]。根据美国临床和实验室标准协会（NCCLS）关于抗菌药物敏感性试验操作标准，采用MH 肉汤稀释法测定优势降解菌株的MIC。取无菌小试管（15 nm×150 nm）12 支置于试管架上，于第1 管加入MH 肉汤1.6 mL，第2～12管各加MH肉汤1.0 mL。于第1管中加入浓度为1 280µg·mL-1的抗生素0.4 mL，混匀后取1.0 mL 至第2 管，第2 管混匀后取1.0 mL 至第3 管，如此连续倍比稀释至第11 管，并从第11 管中吸取1.0 mL溶液弃去，第12 管为不含抗生素的对照组。此时各试管中抗生素浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 µg·mL-1和0.25 µg·mL-1。然后将菌悬液浓度校正至OD600nm=0.1，并在每管内加入该菌液各1.0 mL。第1 管至第11 管抗生素终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 µg·mL-1和0.125 µg·mL-1。然后将其放至摇床中培养24 h（培养条件为：27 ℃、180 r·min-1）。然后在波长为600 nm 处，测定每管的吸光度值（每组样品设置3组平行）。

1.3.5 环丙沙星对菌株降解性能的影响

菌株活化后，将处于对数生长期的细菌悬液用LB 液体培养基调整至OD600nm=0.1，分别加入终浓度为0.1 mmol·L-14-CNB 标准品，然后加入1 280 µg·mL-1的环丙沙星溶液，使溶液中环丙沙星的终浓度分别为1/4 MIC、1/2 MIC、MIC 和4 MIC（1、2、4 µg·mL-1和16µg·mL-1）。CK为空白对照组，27 ℃、180 r·min-1摇床培养9 h 后取样，分别检测4-CNB 在降解前后的浓度，计算得到其降解效率。

1.3.6 生长曲线的测定

将处于对数生长期的细菌悬液用新鲜灭菌的LB培养基调整至OD600nm=0.1，加入1 280µg·mL-1的环丙沙星溶液，使溶液中环丙沙星的终浓度为1/4MIC、1/2MIC、MIC 和4MIC。CK0为不加抗生素和4-CNB 的空白对照组，CKc为加4-CNB、不加抗生素的对照组。27 ℃恒温培养箱中分别培养4、8、12、24 h 和48 h 后，用酶标仪（美国Bio-Tek 公司）于600 nm 波长处测OD值（每组样品设置3组平行）。

1.3.7 细胞活性的测定

将处于对数生长期的细菌悬液用新鲜灭菌的LB培养基调整至OD600nm=0.1，加入1 280µg·mL-1的环丙沙星溶液，使溶液中环丙沙星的终浓度为1/4MIC、1/2MIC、MIC 和4MIC。CK0为不加抗生素和4-CNB 的空白对照组，CKc为加4-CNB、不加抗生素的对照组。27 ℃恒温培养箱中分别培养4、8、12、24 h 和48 h 后，取每种样品100µL于96孔板中，迅速分别加入CCK-8（Cell Counting Kit-8）指示剂10 µL 混匀后，于37 ℃恒温培养箱中静置1 h。然后于450 nm 波长处测OD值（每组样品设置3组平行）。

1.3.8 SOD酶活力测定

将处于对数生长期的细菌悬液用新鲜灭菌的LB培养基调整至OD600nm=0.1，加入1 280µg·mL-1的环丙沙星溶液，使溶液中环丙沙星的终浓度为1/4MIC、1/2MIC、MIC 和4MIC。CK0为不加抗生素和4-CNB 的空白对照组，CKc为加4-CNB、不加抗生素的对照组。27 ℃恒温培养箱中培养9 h 后，使用总SOD 活性检测试剂盒（WST-8 法）测定细菌培养液中SOD 的活性。每组各设4个复孔，每组试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 不同菌株对4-CNB的生物降解

为比较不同菌株对4-CNB 降解效率的差异，利用9 种4-CNB 天然降解菌株分别降解终浓度为0.1 mmol·L-1的4-CNB，结果如图1所示。其中，CT1降解能力最强，经9 h 降解后其降解率即可达98.4%±0.2%，与其他菌株降解效率均有显著差异（P＜0.05）。李明堂等[17]选用恶臭假单胞菌（Pseudomonassp.）和醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）在纯培养条件（25 ℃、160 r·min-1）下混合培养6 d，对4-CNB 降解率为94.5%，CT1 与其相比具有明显优势。因此本研究选择CT1 开展抗生素对4-CNB 降解影响的研究。

2.2 18种抗生素的MIC

在18种常见抗生素中，仅有6种抗生素存在MIC（表1），其中环丙沙星的MIC值最低，为4µg·mL-1，链霉素MIC 最高，为64µg·mL-1。由于环丙沙星对CT1的抑制作用最为显著且环境中氟诺酮类抗生素的污染比较严重，因此选择环丙沙星进行后续试验，研究不同浓度环丙沙星对菌株CT1的影响。

表1 不同抗生素对CT1的最低抑菌浓度Table1 Minimum inhibitory concentration of different antibiotics on CT1

2.3 环丙沙星对菌株CT1降解4-CNB的影响

环丙沙星对菌株CT1 降解4-CNB 的影响如图2所示，不同浓度的环丙沙星均导致菌株对4-CNB 的降解率显著低于CK。随着环丙沙星浓度的增加，菌株对4-CNB 的降解率随之降低。当环丙沙星浓度分别为1/4MIC、1/2MIC，MIC 和4MIC 时，4-CNB 降解率分别为87.0%±3.3%、78.5%±2.4%、67.8%±3.7%和35.7%±3.9%。这表明环丙沙星会抑制CT1 的降解，从而在一定程度上影响环境中4-CNB 的生物降解。宋国滨等[18]研究发现，在亚抑菌浓度的头孢西丁及阿米卡星作用下，与对照组相比，3 种浓度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC）的2 种抗生素对2 种毒力基因均有明显的抑制作用（P＜0.05）。梁珂娟等[19]研究发现环丙沙星会抑制DNA 的合成和复制，因此环丙沙星可能是通过抑制菌株CT1 的DNA 的合成和复制，从而抑制菌株的生长，降低4-CNB的降解。

2.4 环丙沙星对菌株CT1生物量的影响

采用紫外分光光度法研究了不同浓度环丙沙星对CT1 菌株生物量的影响，结果如图3 所示。随着培养时间延长，CK0和仅添加4-CNB（CKc）的对照组其菌体浓度均显著增加。但是，在4-CNB 存在条件下，与CK0相比，菌体浓度有所下降。这说明4-CNB作为降解底物会对菌体产生一定的抑制作用。

对比CK0和CKc，加入环丙沙星后，环丙沙星明显抑制了菌体的生长。经过48 h的培养，CK0的OD600nm值增至1.030，生长迅速。而当环丙沙星浓度分别为1/4MIC、1/2MIC、MIC、4MIC 时，菌体浓度OD600nm值分别为0.333、0.274、0.239、0.153。但是，当环丙沙星浓度高于MIC时，菌株并没有被完全杀死，这是因为当抗生素浓度高于MIC值后，在短时间内对受试菌的生长产生了抑制，而并不是完全杀死受试菌[20]；只有当抗生素浓度大于等于最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration，MBC）时，才能杀死99.9%以上的受试菌。

2.5 环丙沙星胁迫下菌体CT1的细胞活性的变化

采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法，比较了在不同浓度的环丙沙星胁迫下CT1细胞活性的变化，结果如图4 所示。由对照组CKc结果可知，4-CNB 对菌体存在一定的抑制作用，0～12 h 时，抑制作用随着时间的延长而增强。在12 h 后，随着4-CNB 的降解，细胞活性逐渐升高。环丙沙星的浓度低于MIC时，随着环丙沙星浓度的升高，细胞的抑制率逐渐升高。在0～24 h 时，细胞的抑制率呈增加趋势，在24～48 h 时，抑制率的增加趋势逐渐放缓，即环丙沙星对CT1的抑制作用达到最大。这与前述不同浓度环丙沙星对菌体CT1增殖的影响结果相同。

2.6 环丙沙星对细胞内SOD酶活性的影响

SOD酶广泛分布于生物中，是生物体内用于清除超氧阴离子自由基的重要抗氧化酶[21]。通过测定CT1菌细胞内的总SOD 酶活性，探讨CT1菌体在不同浓度环丙沙星胁迫下细胞内酶活性的变化。由图5可知，在没有抗生素但有4-CNB的存在时（CKc），CT1菌体与对照组（CK0）SOD 酶活性没有显著差异（P＞0.05），分别为21.0 U·mL-1和20.8 U·mL-1。由此可见，4-CNB 对CT1 菌体细胞内酶活性没有显著影响（P＞0.05）。而随着环丙沙星浓度的增加，CT1 菌体细胞内SOD 酶活性分别下降了4.5%、18.0%、20.9%和43.2%。由此可见，环丙沙星对细胞内SOD 酶活性的抑制作用，是细胞增殖受抑制的主要原因之一。

3 讨论

近年来，已有多位学者筛选得到降解4-CNB 的菌株，LIU 等[22]分离得到的Pseudomonas stutzeri需84 h才能降解0.5 mmol·L-1的邻氯硝基苯。KATSIVELA等[23]分离得到单一菌株Comamonas.sp，在36 h可降解1.3 mmol·L-1的4-CNB。本文首先通过对比9 株菌降解4-CNB 的差异，选择降解效果最佳的菌株。结果表明，睾丸酮丛毛单胞菌CT1 降解4-CNB 效果最佳，在9 h时，可降解98.4%的0.1 mmol·L-1的4-CNB。由此可知，菌株CT1 具有高效降解4-CNB 的能力，因此本研究最终选用菌株CT1开展生物降解的研究。

环境中的4-CNB 污染物通常与抗生素共存。李威等[24]调查得知，天津冬季某耕地磺胺类抗生素残留量为2.6～12.5 µg·kg-1；喹诺酮类抗生素残留量为10.3～30.1µg·kg-1。朱宇恩等[25]选取山西省汾河沿岸的农田土壤为研究对象，检测到环丙沙星浓度为0.54 µg·kg-1。在抗生素存在的情况下，细菌在环境中能否正常生长，能否实现本身的降解功能还要视其对应的MIC 值和抗生素在环境中的残留浓度。因此本试验研究了18 种常用抗生素对菌株CT1 的MIC。结果显示：环丙沙星、四环素、卡那霉素、庆大霉素、红霉素和链霉素的MIC 分别是4、16、16、32、32µg·mL-1和64µg·mL-1。这些抗生素的MIC 浓度远比环境中残留的浓度高，但某些含抗生素的医药废弃物、滥用抗生素的人畜产生的粪便随意排放，可能会造成某污染点瞬时浓度过高甚至远超出这个浓度水平，从而影响CT1正常的生理功能。因此在使用菌株CT1进行环境修复时，也要考虑这些抗生素的不良影响。所以本研究选用环境中残留最广泛和MIC 值最低的环丙沙星进行相关试验。

通过4-CNB-环丙沙星联合培养，研究在不同环丙沙星浓度作用下菌株的生长情况和降解情况。结果显示：与CK 相比，不同浓度环丙沙星均会抑制菌株CT1降解4-CNB，且不同浓度环丙沙星对菌株CT1的抑制均存在显著差异（P＜0.05）。黄莺[26]的研究发现红霉素浓度高于0.25µg·mL-1（MIC）即会抑制细菌的生长和菲的降解，红霉素胁迫可显著改变降解菌的蛋白表达，尤其是降解相关的蛋白表达量下调。因此环丙沙星可能也是通过抑制降解4-CNB 基因的合成，而降低了4-CNB的降解效率。

CCK-8 法具有灵敏、重现性好等特点，细胞线粒体中的脱氢酶在电子载体的作用下可将CCK-8 还原为甲臜产物，甲臜产物的数量与活细胞的数量成正比，可间接反映出活细胞的数量，同时也可间接反映出抗生素的毒性[27]。加入不同浓度环丙沙星后，菌株的生物量和细胞活性均受到显著抑制。且随着培养时间的延长抑制逐渐增强。菌体的生长繁殖受多种因素的影响。SOD 是生物体内用于清除超氧阴离子自由基的重要抗氧化酶[28]，本研究通过测定CT1 的SOD 酶活性来探讨环丙沙星对该菌株生长的抑制情况。细胞代谢过程中会产生活性氧，活性氧的产生和清除在细胞正常增殖和代谢时一般会保持动态平衡。如若失衡则会导致氧化胁迫，并对生物膜、酶等造成可逆或不可逆损伤，损伤严重时还可引起细胞死亡[29]。本试验中与CK 相比，加入不同浓度的环丙沙星均会导致菌株SOD 酶活性显著下降，菌株SOD酶活性的下降可能是菌体生物量下降、细胞活性受到抑制的主要原因。研究表明[30]，环丙沙星主要作用于细胞DNA 解旋酶的A 亚单位，抑制DNA 的合成和复制，从而起到抗菌作用。因此环丙沙星可能是通过抑制DNA 的合成和复制，降低SOD 酶活性，从而引起活性氧对菌体损伤，这可能是环丙沙星对细胞毒性机制的一部分重要内容。

由于环境中抗生素的残留一般为痕量水平[31]，远低于试验中使用的环丙沙星浓度，而且即使添加高于环境浓度100～1 000 倍的环丙沙星（MIC），菌株CT1 仍具有较为良好的降解性能，降解率能达到67.7%以上。这说明菌株CT1 在自然环境中的正常生理功能不易受到环丙沙星的抑制，因此其有望直接应用于我国各类环境介质中4-CNB 的去除，具有一定的应用前景。