佳乐麝香与镉污染对土壤微生物和酶活性的影响

赵芷玉，律泽，魏炜，韩晓墨

（沈阳建筑大学市政与环境工程学院，沈阳 110168）

佳乐麝香（HHCB）是一种具有特殊香味的疏水性多环类有机物[1]，现已作为工业香料被广泛地应用于日用化工产业，如香水、洗发水、沐浴露、肥皂和洗衣粉等产品中[2]，且随着污水灌溉和污泥农田施用，在土壤中浓度也越来越高。HORII 等[3]对美国Kentucky和Georgia 的两座大型污水处理厂进水中的HHCB 残留浓度分别进行了检测，结果表明在进水口中HHCB的残留浓度最高达7 000 ng·L-1。GUERRA 等[4]对美国的两座大型污水处理厂排出的污泥进行检测，发现HHCB 含量已达到14 300 µg·kg-1。陈多宏等[5]发现日用化妆品生产工厂排放的污泥中HHCB 浓度已达到566 mg·kg-1。随着HHCB在自然环境中浓度增高，生态风险也越来越大，导致其生态毒理效应增强。HHCB 是潜在的内分泌干扰物，李明等[6]发现HHCB可造成斑马鱼胚胎甲状腺激素分泌和调节的紊乱。HHCB 的遗传毒性效应主要表现在生殖能力方面，MELMED[7]发现在动物试验中，麝香酮可以使雄性动物生殖器官萎缩。HHCB 对生物的生理生态效应主要是对其生态结构有影响，姜丽思等[8]发现较低剂量的HHCB 胁迫就能够导致萝卜根尖基因组DNA 损伤，且随浓度升高损伤加重。

目前，重金属污染日益严重，随着公众的环境意识提高，重金属污染受到越来越多的关注[9]。土壤中的Cd可移动性强，且具有可积累性，积累到一定剂量就会影响人体健康。由于土壤中HHCB 与Cd 均可通过污水灌溉及污泥农田施用途径输入土壤，土壤受二者复合污染的问题也日益突出。

目前针对HHCB 与Cd 复合污染的研究大多集中于水生生物和陆生生物，对土壤微生物方面的研究相对较少。陈翠红[10]研究发现多环麝香和Cd 对小麦根伸长和芽伸长具有明显的抑制作用，且存在剂量-效应关系。ZHANG等[11]研究发现HHCB和Cd对斑马鱼抗氧化系统具有联合效应，试验初期为Cd 起决定性作用，而在其余的暴露时间内，HHCB 起主要作用，斑马鱼暴露于HHCB 时，其总蛋白减少，可能是斑马鱼损伤的重要原因。

在土壤微生物生态系统中，微生物数量、酶活性等因素是一个随着环境变化而变化的动态过程。由于土壤酶主要来自土壤微生物的生命活动，污染物的胁迫会导致土壤中微生物种群活细胞的数量和组成发生变化，因此，也影响了土壤微生物的活性。本研究以HHCB 和Cd 为污染物，在实验室培养80 d 后，分别研究二者单一及复合污染下对土壤中微生物数量和土壤酶活性的影响，进而研究二者复合污染对土壤的生态毒理效应，可为复合污染土壤的生物修复提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤采集于辽宁省沈阳市石佛寺灌渠渠首（42°08.611′N，123°20.705′E），取农田表层（0～20 cm）土壤。土壤理化性质如表1所示。

表1 土壤理化性质Table1 Soil physical and chemical properties

1.2 供试药品

HHCB 标准样品购于英国Promochem 公司，纯度为75%，其分子式均为C18H26O。国产分析纯CdCl2·2.5H2O购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验方法

本试验采用微宇宙实验法，对培养80 d后的土壤中微生物数量以及酶活性进行研究。新鲜土壤采集并拣去植物残体后装于聚乙烯塑料袋中保鲜，带回实验室过2 mm 筛。称取200 g（以干土计）土壤于500 mL 的塑料烧杯中，调节含水量至田间最大持水量的60%左右，用具有透气作用的薄膜封口，防止水分过量蒸发和空气中的菌体进入，并将其置于25 ℃恒温培养箱中避光预培养7 d。预培养结束后，采用土壤染毒法进行染毒。

将过2 mm 筛后的供试土壤采用二因素分别为4水平（HHCB 浓度分别为0、100、400 mg·kg-1和800 mg·kg-1）和2 水平（Cd 浓度分别为0 和10 mg·kg-1）的完全组合试验。分为CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7共8个处理组（表2），每个处理重复3次。

表2 不同处理中Cd与HHCB 浓度情况（mg·kg-1）Table2 Concentrations of Cd and HHCB in different treatments（mg·kg-1）

将各处理组的土样充分混匀后，以80 d作为培养周期，将其置于25 ℃的恒温培养箱中，在整个过程中保持土壤湿度在最大持水量的60%左右，每2～3 d 调节一次土壤含水量，使培养过程中土壤含水量保持恒定。于培养第1 d 和第80 d 采集土壤，分别测定土壤中细菌、真菌和放线菌的数量以及土壤脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶的活性。

1.4 测定方法

1.4.1 土壤微生物测定方法

（1）可培养微生物的测定方法：采用固体平板稀释涂布培养计数法，其中细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用马丁培养基，放线菌采用高氏培养基。

（2）微生物总数的测定方法采用荧光qPCR 法。DNA 的提取：使用Fast DNA-SPIN KitForSoil 试剂盒，从0.5 g 土壤中提取基因组DNA，并将其溶于50 µL水中，保存温度为-20 ℃。测定基因的拷贝数：采用荧光定量qPCR 测定细菌16S rRNA、真菌18S rRNA和放线菌特异基因的拷贝数（以干土计）。制作标准曲线，样品中的基因拷贝数根据所得标准曲线计算，然后换算成每克干土的基因拷贝数。

1.4.2 土壤酶活性测定方法

土壤脲酶活性测定采用苯酚钠法；土壤蔗糖酶活性测定采用3、5-二硝基水杨酸法；土壤酸性磷酸酶活性测定采用对硝基酚比色法。

1.5 数据分析

试验数据采用DPS 7.5 进行处理，结果以平均值±标准差表示，利用多因素方差分析中Turkey 多重比较检验不同处理间的结果差异显著性。显著性水平为P＜0.05，极显著水平为P＜0.01。试验作图采用Origin 8。

2 结果与分析

2.1 HHCB与Cd污染对土壤中微生物数量的影响

土壤微生物对土壤的改变十分敏感[12]，因此可作为土壤质量的一个重要指标，在讨论复合污染对土壤质量影响时，可通过测定微生物的数量进行土壤质量的评定[13]。

2.1.1 HHCB和Cd污染对可培养细菌数的影响

不同处理可培养细菌数方差分析结果见图1，培养时间为1 d 时，与CK 相比，所有处理可培养细菌数均表现为显著降低（P＜0.05）。HHCB 单一污染对细菌生长表现为抑制作用，H1、H2 和H3 中细菌数分别显著低于CK 15.09%、15.99%和30.98%，且随着浓度的增加，细菌数减少。Cd 单一污染对细菌生长呈现出较大的抑制效果，H4 处理下细菌数显著低于CK 49.96%。HHCB 与Cd 复合污染对细菌生长也表现为抑制作用，H5、H6 和H7 中细菌数分别显著低于CK 27.24%、43.29%和59.32%。

表3 细菌、真菌、放线菌引物和PCR条件Table3 Bacteria，fungi，actinomycetes primers and PCR conditions

培养时间为80 d 时，与CK 相比，除H1 和H4 外，其他处理均表现为差异显著（P＜0.05）。HHCB 单一污染对细菌生长表现为促进作用，H2和H3中细菌数分别显著高于CK 3.18 倍和3.34 倍。HHCB 与Cd 复合污染对细菌生长也表现为促进作用，H5、H6 和H7中细菌数分别显著高于CK 2.25、4.82倍和5.09倍，H7对细菌的促进效果最显著。培养时间为80 d时，各处理浓度的细菌数均高于培养时间为1 d 的细菌数（CK、H1 除外），H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分别为培养时间为1 d 时的3.33、4.25、1.09、4.64、9.13 倍和9.89倍，CK 和H1 的细菌数分别低于培养时间为1 d 时35.80%和24.60%。结果表明，培养时间为1 d 时，HHCB 与Cd 单一及复合污染对细菌生长表现为抑制作用；培养时间为80 d 时，HHCB 单一及与Cd 复合污染对细菌生长表现为促进作用（H1除外）。

2.1.2 HHCB和Cd污染对可培养真菌数的影响

不同处理可培养真菌数方差分析结果见图2，培养时间为1 d时，与CK相比，除H3和H7外，其他处理均表现为差异显著（P＜0.05）。HHCB 单一污染对真菌生长表现为促进作用，H1和H2中真菌数分别显著高于CK 2.14 倍和1.80 倍。Cd 单一污染对真菌生长呈现出显著的抑制效果，H4 处理下真菌数显著低于CK 85.90%。HHCB 与Cd 复合污染对真菌生长也表现为促进作用，H5 和H6 中真菌数分别显著高于CK 4.32倍和3.33倍。

培养时间为80 d时，与CK相比，除H4外，其他处理浓度均表现为差异显著（P＜0.05）。HHCB 单一污染对真菌生长表现促进作用，H1、H2 和H3 中真菌数分别显著高于CK 9.51、4.36 倍和4.30 倍。HHCB 与Cd 复合污染对真菌生长表现为促进作用，H5、H6 和H7 中真菌数分别显著高于CK 10.69、5.62 倍和4.14倍。培养时间为80 d时，各处理浓度的真菌数均高于培养时间为1 d 的可培养真菌数，CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分别高于培养时间为1 d 时的12.78%、175.00%、41.09%、169.00%、346.00%、43.70%、16.50%和431.00%。试验结果表明，HHCB单一及与Cd复合污染对真菌生长表现为促进作用。

2.1.3 HHCB和Cd污染对可培养放线菌数的影响

不同处理可培养放线菌数方差分析结果见图3，培养时间为1 d 时，与CK 相比，所有处理浓度均表现为差异显著（P＜0.05）。HHCB 单一污染对放线菌生长表现抑制作用，H1、H2 和H3 处理的放线菌数分别显著低于CK 57.22%、76.88%和91.32%。Cd 单一污染对放线菌生长表现抑制作用，H4 处理的放线菌数显著低于CK 80.97%。HHCB 与Cd 复合污染对放线菌生长也表现抑制作用，H5、H6 和H7 处理的放线菌数分别显著低于CK 63.38%、79.38%和90.21%。

培养时间为80 d时，与CK相比，所有的处理均表现为差异显著（P＜0.05）。HHCB 单一污染对放线菌生长表现为抑制作用，H1、H2 和H3 处理的放线菌数分别显著低于CK 82.90%、97.10%和98.70%。Cd 单一污染对放线菌生长表现为抑制作用，H4 处理的放线菌数显著低于CK 78.78%。HHCB 与Cd 复合污染对放线菌生长表现为抑制作用，H5、H6 和H7 处理的放线菌数分别显著低于CK 76.50%、94.50% 和98.90%。培养时间为80 d 时，各处理浓度的放线菌数均低于培养时间为1 d 的放线菌数，CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分别低于培养时间为1 d 时的16.50%、67.20%、89.10%、89.20%、6.67%、35.07%、67.05%和38.66%。试验结果表明，HHCB 与Cd 单一及复合污染对放线菌生长均表现为抑制作用。

2.1.4 HHCB和Cd污染对微生物基因拷贝数的影响

（1）细菌16S rRNA基因拷贝数

经方差分析后可知，与CK 相比，只有H7 表现为差异显著（P＜0.05）。由图4 可知，在H7 处理下，细菌16S rRNA 基因拷贝数显著高于CK 76.98%。HHCB单一及与Cd 复合污染（除H7 外），不同浓度的HHCB处理细菌16S rRNA 基因拷贝数均没有显著差异（P＞0.05），但细菌基因拷贝数随着HHCB 浓度的增加而增加。

（2）真菌18S rRNA基因拷贝数

经方差分析后可知，与CK 相比，只有H4 表现为差异显著（P＜0.05）。由图5 可知，Cd 单一污染下，H4处理的真菌18S rRNA 基因拷贝数显著高于CK 1.07倍。HHCB 单一及与Cd 复合污染下，不同浓度的HHCB 处理真菌18S rRNA 基因拷贝数均没有显著差异（P＞0.05），但真菌基因拷贝数随着HHCB 浓度的增加而减少。

（3）放线菌基因拷贝数

经方差分析后可知，与CK相比，所有的处理均表现为差异显著（P＜0.05）。由图6 可知，HHCB 单一污染对放线菌生长表现为抑制作用，H1、H2 和H3 处理的放线菌基因拷贝数分别显著低于CK 38.59%、79.56%和84.78%。Cd 单一污染对放线菌生长表现为抑制作用，H4 处理的放线菌基因拷贝数显著低于对照组80.5%。HHCB 与Cd 复合污染对放线菌生长表现为抑制作用，H5、H6 和H7 处理的放线菌基因拷贝数分别显著低于CK 46.80%、68.02%和92.29%。试验结果表明，HHCB 与Cd 单一及复合污染对放线菌表现为抑制作用，且放线菌基因拷贝数随着HHCB浓度的增加而减少。

2.2 HHCB与Cd污染对土壤酶活性的影响

土壤酶来源于土壤根系微生物的生命活动，能够有效地催化土壤根系活动[14]。土壤酶能够催化土壤内复杂的生化反应，例如腐殖质的分解合成以及有机物的水解与转化等，因此土壤酶活性反映了特定土壤条件下生化过程的相对强弱[15]。通过测定相应酶的活性，能够间接了解物质在土壤中的代谢情况，因此可通过测定土壤酶活性来判断土壤修复的程度。

2.2.1 HHCB与Cd污染对脲酶活性的影响

不同处理脲酶活性方差分析结果见图7，培养时间为1 d时，与CK相比，除H3和H7外，其他处理浓度均表现为差异显著（P＜0.05）。HHCB 单一污染对脲酶活性表现为抑制作用，H1和H2处理的脲酶活性分别显著低于CK 11.67%和28.08%。Cd 单一污染对脲酶活性表现为促进作用，H4 处理的脲酶活性显著高于CK 67.17%。HHCB 与Cd 复合污染对脲酶活性也表现为抑制作用，H5和H6处理的脲酶活性的分别显著低于CK 14.50%和26.24%。

培养时间为80 d时，与CK相比，所有的处理均表现为差异显著（P＜0.05）。HHCB 单一污染对脲酶活性表现为抑制作用，H1、H2 和H3 处理的脲酶活性分别显著低于CK 17.60%、32.25%和19.85%。Cd 单一污染对脲酶活性表现为促进作用，H4 处理的脲酶活性显著高于CK 50.42%。HHCB 与Cd 复合污染对脲酶活性表现为抑制作用，H5、H6 和H7 处理的脲酶活性分别显著低于CK 15.01%、26.70%和18.9%。培养时间为80 d时，各处理浓度的脲酶活性均低于培养时间为1 d 的脲酶活性，CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分别低于培养时间为1 d 时的0.90%、7.50%、6.60%、7.20%、9.85%、1.40%、0.60%和2.46%。试验结果表明，培养时间为1 d 时，HHCB 单一及与Cd 复合污染对脲酶活性表现为抑制作用（H3、H7 除外）。培养时间为80 d 时，HHCB 单一及与Cd 复合污染对脲酶活性表现为抑制作用。

2.2.2 HHCB与Cd污染对蔗糖酶活性的影响

不同处理下蔗糖酶活性方差分析结果见图8，培养时间为1 d 时，与CK 相比，所有处理浓度均表现为差异显著（P＜0.05）。HHCB单一污染对蔗糖酶活性表现为抑制作用，H1、H2 和H3 处理的蔗糖酶活性分别显著低于CK 22.90%、54.20%和64.13%。Cd 单一污染对蔗糖酶活性表现为抑制作用，H4处理的蔗糖酶活性显著低于CK 33.72%。HHCB 与Cd 复合污染对蔗糖酶活性表现为抑制作用，H5、H6 和H7 处理的蔗糖酶活性分别显著低于CK 39.82%、55.39%和67.90%。

培养时间为80 d时，与CK相比，所有的处理均表现为差异显著（P＜0.05）。HHCB 单一污染对蔗糖酶活性表现为抑制作用，H1、H2 和H3 处理的蔗糖酶活性分别显著低于CK 16.80%、37.01%和51.98%。Cd单一污染对蔗糖酶活性表现为抑制作用，H4 处理的蔗糖酶活性显著低于CK 10.70%。HHCB 与Cd 复合污染对蔗糖酶活性表现为抑制作用，H5、H6 和H7 处理的蔗糖酶活性分别显著低于CK 22.40%、44.49%和56.97%。培养时间为80 d 时，各处理浓度下的蔗糖酶活性均低于培养时间为1 d的蔗糖酶活性，CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分别低于培养时间为1 d 时的29.90%、24.40%、3.70%、6.20%、5.60%、9.70%、12.80%和5.90%。试验结果表明，HHCB 与Cd 单一及复合污染对蔗糖酶活性均表现为抑制作用。

2.2.3 HHCB与Cd污染对酸性磷酸酶活性的影响

不同处理下酸性磷酸酶活性方差分析结果见图9，培养时间为1 d 时，与CK 相比，所有处理浓度均表现为差异显著（P＜0.05）。HHCB 单一污染对酸性磷酸酶活性表现为抑制作用，H1、H2 和H3 处理的酸性磷酸酶活性分别显著低于CK 24.20%、22.40%和16.48%。Cd 单一污染对酸性磷酸酶活性表现为抑制作用，H4 处理的酸性磷酸酶活性显著低于CK 13.76%。HHCB 与Cd 复合污染对酸性磷酸酶活性表现为抑制作用，H5、H6 和H7 处理的酸性磷酸酶活性分别显著低于CK 31.13%、13.39%和12.87%。

培养时间为80 d 时，与CK 相比所有处理浓度均表现为差异显著（P＜0.05）。HHCB 单一污染下，H1对酸性磷酸酶活性表现为抑制作用，H2和H3对酸性磷酸酶活性表现为促进作用。H1处理的酸性磷酸酶活性显著低于CK 13.60%，H2 和H3 处理的酸性磷酸酶活性分别显著高于CK 37.00%和81.70%。HHCB与Cd 复合污染下，H5 对酸性磷酸酶活性表现为抑制作用，H6 和H7 对酸性磷酸酶活性表现为促进作用。H5 处理的酸性磷酸酶活性显著低于CK 23.40%，H6和H7 处理的酸性磷酸酶活性分别显著高于CK 37.80%和71.90%。培养时间为80 d 时，各处理浓度的酸性磷酸酶活性均高于培养时间为1 d的酸性磷酸酶活性，CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分别高于培养时间为1 d 时的20.50%、37.40%、112.90%、162.30%、40.15%、34.09%、92.99%和137.80%。试验结果表明，培养时间为1 d 时，HHCB 与Cd 单一及复合污染下对酸性磷酸酶活性表现为抑制作用。培养时间为80 d 时，HHCB 单一及与Cd 复合污染对酸性磷酸酶活性表现为促进作用（H1、H5 除外），H1 和H5对酸性磷酸酶活性表现为抑制作用。

3 讨论

本研究中，HHCB 单一及与Cd 复合污染对真菌生长表现为促进作用。BARAN 等[16]发现在被有机物污染的土壤中产生的真菌具有降解污染物的能力。微生物适应后，其呼吸强度、发育程度和降解污染物的能力都有所提高。由此推测产生该结果的原因主要是微生物对污染物的适应作用或利用降解后污染物作为碳源和能量。

本研究中，培养时间为1 d 时，HHCB 与Cd 单一及复合污染显著抑制了细菌和放线菌生长，可能是由于HHCB 作为一种脂溶性化合物，使细胞膜的通透性发生改变，外部的污染物质更容易侵入微生物细胞，从而抑制微生物细胞生长；而Cd 作为常见的重金属毒性物质，能够在HHCB 的基础上进一步增加对微生物细胞的毒性[17]。

本研究中，HHCB 单一及与Cd 复合污染显著抑制了脲酶和蔗糖酶的活性。该结果可能是由于HHCB 与土壤酶分子中的活性部分结合，与底物形成了竞争作用，进而抑制了脲酶的活性[18]；而土壤蔗糖酶可增加土壤中的易溶性营养物质，HHCB 作为一种疏水性物质，会降低易溶性的营养物质溶解，且有助于提高Cd2+生物有效性，促进土壤对HHCB 的吸附固定，进而抑制蔗糖酶活性；在培养时间为80 d 时，100 mg·kg-1HHCB 的单一及与Cd 复合污染显著抑制酸性磷酸酶活性，而400、800 mg·kg-1HHCB 的单一及与Cd复合污染则显著促进酸性磷酸酶活性。这可能是由于随着土壤中HHCB 浓度的增大，激活了土壤中能够降解HHCB 的那部分微生物的活性，从而加快了酶的合成，提高了酶活性[19]。

HHCB 与Cd 单一及复合污染对脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶的活性产生了不同程度的影响，其主要原因可能有两点：其一，土壤酶在不同土壤环境中表现出的功能差异。脲酶与土壤中氮的转化相关，酸性磷酸酶与土壤中有机磷的分解转化有关，而蔗糖酶与土壤中有机质的转化有关，因此不同土壤酶对污染物的影响表现出不同的效应[20]。其二，土壤酶对复合污染物的响应机制相对复杂，并非单一污染物的简单叠加作用，土壤酶会随着污染物种类、土壤类型以及自然条件下的环境因素的变化而变化[21]。此外，其他原因也能导致HHCB 单一及与Cd 复合污染对土壤酶活性的作用不同，这还需进一步研究分析。

4 结论

（1）平板菌落计数结果显示，HHCB 单一及与Cd复合污染培养时间为1 d时，对细菌表现为抑制作用，培养时间为80 d 时，对细菌表现为促进作用（HHCB为100 mg·kg-1的单一污染除外），对真菌生长均表现为促进作用，对放线菌生长均表现为抑制作用。荧光qPCR 法下，细菌16S rRNA 基因拷贝数随着HHCB 浓度的升高而增加，而真菌18S rRNA基因拷贝数和放线菌拷贝数随着HHCB浓度的升高而降低。

（2）培养时间为1 d 时，HHCB 单一及与Cd 复合污染对脲酶活性表现为抑制作用（HHCB 为800 mg·kg-1污染除外），对蔗糖酶和酸性磷酸酶表现为抑制作用；培养时间为80 d 时，对脲酶表现为抑制作用。培养时间为80 d 时，400、800 mg·kg-1HHCB 单一及与Cd复合污染对酸性磷酸酶活性表现为促进作用。