贵州省两栖动物新记录种——武陵掌突蟾

刘京，李仕泽，程彦林，陈龙，张霞，魏刚

(1.茅台学院资源环境系，贵州仁怀564500； 2.贵阳学院生物多样性保护重点实验室，贵阳550002)

掌突蟾属Leptobrachella广泛分布于亚洲大陆东南部，包括中国南部及印度东北部及东南亚群岛等，目前该属已报道82种(Frost, 2020)，其中，中国记录分布26种，贵州省记录分布8种，分别为峨山掌突蟾L.oshanensis、蟼掌突蟾L.pelodytoides、福建掌突蟾L.liui、腹斑掌突蟾L.ventripunctata、毕节掌突蟾L.bijie、紫腹掌突蟾L.purpuraventra、绥阳掌突蟾L.suiyangensis和赤水掌突蟾L.chishuiensis(中国两栖类，2020)。峨山掌突蟾主要分布在贵州印江、雷山、罗甸、江口等地(伍律等，1986；魏刚等，2017)，蟼掌突蟾主要分布在贵州安龙和雷山等地(伍律等，1986)，福建掌突蟾分布在贵州东南部雷山等地(费梁等，2012)，腹斑掌突蟾分布在贵州西北部习水等地(李光荣等，2016)，毕节掌突蟾和紫腹掌突蟾分布在贵州毕节等地(Wangetal.，2019)，绥阳掌突蟾分布在贵州绥阳(Luoetal.，2020)，赤水掌突蟾分布在贵州赤水(Lietal.，2020)。

2016年4月4日在江口县梵净山国家级自然保护区(108°46′8.07″E，27°50′56.77″N，海拔539 m)进行两栖动物调查时，采集到掌突蟾属成体标本1号(表1)。2016年6月6日，在雷山县雷公山国家级自然保护区(108°11′47.2″E，26°22′42.24″N，海拔1 687 m)进行两栖动物调查时，采集到掌突蟾属成体标本1号(表1)。经形态学比较和系统发育分析，鉴定为武陵掌突蟾Leptobrachellawulingensis，为贵州省两栖动物分布新记录种。本文对其形态特征及生态习性进行描述，并初步探讨其形态特征的地理变异，为掌突蟾属物种的系统学和谱系地理学研究提供了新信息。

表1 样品信息表Table 1 Samples used in this study and GenBank accession numbers for sequences

1 材料与方法

1.1 材料

2号标本取肌肉组织存于95%乙醇中，标本浸泡于10%福尔马林溶液中，保存于茅台学院生物学标本室。

1.2 形态鉴定与测量

对2号标本使用游标卡尺(无锡锡工量具有限公司；量程200 mm，精度0.1 mm)进行测量，测量依据《中国两栖动物检索及图鉴》(费梁等，2005)，并参照《中国两栖动物及其分布彩色图鉴》(费梁等，2012)进行形态鉴定。

1.3 分子鉴定

以高盐法提取保存于乙醇中的肌肉组织的DNA。利用引物P7和P8(Simonetal.，1994)扩增16SrRNA基因部分片段并测序。PCR扩增条件和步骤参照Chen等(2017)。扩增产物经电泳检测后，大小符合要求的产物交上海生工生物公司测序。所得序列上传到GenBank。

在GenBank中下载掌突蟾属部分物种16SrRNA基因，结合本次采集标本所测序列，进行分子系统发育分析。以腾冲拟髭蟾Leptobrachiumtengchongense、华深拟髭蟾Leptobrachiumhuashen和大角蟾Megophrysmajor为外群(Lietal.，2020)。所有序列在Clustal X v1.8(Thompsonetal.，1997)中进行比对，采用贝叶斯法(Bayesian-Inference，BI)重建系统发育关系。建树之前，利用jModeltest v2(David，2008)基于AIC标准选择最适核苷酸替代模型。贝叶斯法运算中马尔科夫链的蒙特卡罗方法(Markov chain Monte Carlo process)设置为4条链(3条冷链1条热链)同时运行，共运行10 000 000代，每100代抽样一次，共得到100 001个样本及其相对的似然值和模型参数。在运行500 000代后，似然值趋于稳定，舍弃最初的500 000代(5 000个样本)，剩余的样本构建一致树，并获得系统树的支系结构和各支系的后验概率。用MEGA v6.0(Tamuraetal.，2013)中的Kimura双参数模型计算表1中所列掌突蟾属物种间的遗传距离。

2 结果

2.1 形态描述

本次采集的2号标本(JK20160404001♂、LS20160610007♀)均为成体，体型中等，雄性体长31.0 mm，雌性体长32.2 mm，其他部位量度见表2。头长小于头宽，吻端略凸出于下唇。鼓膜清晰可见，圆形，稍凹陷；无犁骨齿，舌后有缺刻；鼻间距长于眼间距。眼角圆润，瞳孔纵置，上半部分有明亮的金色虹膜，下半部虹膜呈银色。指端圆且稍膨大，手指无蹼和指侧缘膜，指长序为1<2≈4<3，掌突2，椭圆形，内掌突大，外掌突略小。趾端圆形略膨大，趾间有蹼迹，趾侧缘膜狭窄，趾长序为1<2<5<3<4。后肢纤细，左右跟部轻微重叠，后肢贴体前伸时跗关节到达眼中部。无婚垫和关节下瘤。

表2 贵州省采集的武陵掌突蟾成体标本形态量度Table 2 Morphometric measurements of adult Leptobrachella wulingensis from Guizhou Province

体背部灰褐色，有明显的暗褐色斑点，散布有不规则的浅橙色色斑。背部皮肤粗糙，有稀疏的大疣粒。吻背部有不明显的“Y”形斑纹。四肢背面为深棕色横条纹，腹股沟至腋窝两侧为明显的深棕色斑点，纵向排列成2列；肘部和上臂有深棕色条纹和明显的铜黄色；手指和脚趾有明显的深棕色条纹。四肢腹面呈灰紫色，腋上腺、股、胸、腹侧腺清晰可见，呈乳白色(图1)。

比较此次所采集的掌突蟾标本和其他掌突蟾属物种的形态鉴定特征，发现本次采集的标本形态特征与武陵掌突蟾模式产地标本相符。

2.2 系统发育关系和遗传距离

PCR扩增获得的掌突蟾线粒体16SrRNA基因片段长度为495 bp，T、C、A、G含量分别是24.6%、24.6%、30.2%、20.6%，A+T含量高于G+C。本文所用最适核苷酸替代模型为GTR+G+I。

基于贝叶斯构建的系统发育树显示，来自贵州梵净山和雷公山的掌突蟾标本与武陵掌突蟾模式产地(湖南省张家界天全山森林公园)的标本聚为一支，且有较高的支持率(0.94)(图2)。基于Kimura双参数模型估算本研究中所采用的掌突蟾属部分物种的遗传距离(表3)为3.3%～13.2%，平均遗传距离为6.94%。梵净山和雷公山所采的掌突蟾标本与武陵掌突蟾模式产地标本间的遗传距离均为1.6%，远小于掌突蟾属物种间的遗传距离。通过形态比较，在梵净山和雷公山采集的掌突蟾标本与武陵掌突蟾原始描述(Qianetal.，2020)吻合，系统发育分析也支持采自贵州梵净山和雷公山的掌突蟾标本与武陵掌突蟾关系较近。

因此，结合形态比较与分子系统学分析结果，鉴定采集于贵州梵净山和雷公山的掌突蟾标本为武陵掌突蟾，为贵州省两栖动物分布新记录。

2.3 生境描述

本次采集的武陵掌突蟾1号标本来自梵净山国家级自然保护区森林内的溪沟旁(图3：a)，与其同域分布的两栖类有棘腹蛙Quasipaaboulengeri、棘指角蟾Megophrysspinata、华西雨蛙Hylaannectans、中华湍蛙Amolopssinensis、中华蟾蜍Bufogargarizans、武陵瘰螈Paramesotritonwulingensis等。另1号标本采集于雷公山国家级自然保护区的溪沟旁(图3：b)，与其同域分布的两栖类有棘腹蛙、雷山角蟾Megophrysleishanensis、雷山髭蟾Vibrissaphoraleishanensis、中华湍蛙、中华蟾蜍和大树蛙Zhangixalusdennysi等。

3 讨论

掌突蟾属物种在中国广泛分布，大多数物种间形态较为相似，因此在野外很难对其进行鉴定(费梁等，2012)。近年来，随着分子生物学的发展，采用形态比较结合分子系统学分析对物种进行鉴定的方法已广泛应用。

目前贵州省记录的掌突蟾属物种有8种(中国两栖类，2020)。本文通过GenBank下载贵州已有报道的掌突蟾及其近缘种的16SrRNA序列，构建系统发育树，计算遗传距离，发现本文采集的标本和贵州省有记载分布的紫腹掌突蟾、绥阳掌突蟾、赤水掌突蟾、毕节掌突蟾、峨山掌突蟾、蟼掌突蟾、福建掌突蟾和腹斑掌突蟾的遗传距离分别为4.4%、5.3%、5.5%、6.0%、6.7%、11.9%、12.6%和13.2%，和武陵掌突蟾模式产地标本的遗传距离仅为1.6%，且小于其他掌突蟾属物种的遗传距离。

表3 基于16S rRNA基因序列估算的掌突蟾属物种间Kimura双参数遗传距离Table 3 Genetic distance under Kimura 2-parameter model on 16S rRNA gene of Leptobrachella species examined in the study

采自贵州梵净山和雷公山的掌突蟾标本与目前贵州记载的8种掌突蟾属物种在形态上存在明显的差异(表4)。趾基部有蹼迹和狭窄的趾侧缘膜，区别于腹斑掌突蟾和峨山掌突蟾(无趾侧缘膜)、福建掌突蟾(侧缘膜较宽)和蟼掌突蟾(具1/4～1/3蹼，侧缘膜宽)；后肢贴体前伸跗关节达眼中部，区别于赤水掌突蟾(跗关节达鼓膜)和腹斑掌突蟾(跗关节达鼓膜至眼后角)；体腹部白色，胸部和腹部前方有疣粒状白色斑点，区别于紫腹掌突蟾(腹部灰紫色，有灰色斑点)、腹斑掌突蟾(腹部有深褐色斑点)和毕节掌突蟾(腹部有灰白色斑点)；背部皮肤粗糙，有稀疏的大疣粒，区别于绥阳掌突蟾、腹斑掌突蟾、峨山掌突蟾背部无大疣粒。背侧有明显标记，区分于贵州分布所有掌突蟾。侧腹部有黑点，区分于峨山掌突蟾和蟼掌突蟾的大的黑点。本次采集的掌突蟾标本与武陵掌突蟾模式产地的形态上也存在一些差异，如头宽大于头长，不同于模式产地的头长大于头宽或几乎相等的情况；皮肤呈灰棕色，不同于模式产地的体背部皮肤棕色或红棕色。由于本次采集的武陵掌突蟾标本数有限，上述差异是否为适应不同环境而导致的形态变异，有待进一步采集标本进行论证。

表4 贵州分布的掌突蟾属物种形态特征比较Table 4 Morphological comparisons between the Leptobrachella species occurring from Guizhou Province

武陵掌突蟾为中国特有种，此前报道在我国的分布仅限于湖南省武陵山脉，包括张家界市天全山森林公园和天子山自然保护区，海拔为414～979 m的山区(Qianetal.，2020)。此次在贵州省江口县梵净山国家级自然保护区(采集地海拔539 m)和雷山县雷公山国家级自然保护区(采集地海拔1 687 m)发现武陵掌突蟾，丰富了其分布信息，并拓宽了对该物种分布海拔的认识。