生牛奶中分离大肠杆菌对季铵盐类消毒剂耐药性研究

郭莉娟，孙丰慧，张艳娇 ，刘海锋，廖小微，代敏*

(1.成都医学院检验医学院，成都610500；2.成都医学院，四川省动物源性兽药残留防控工程实验室，成都610500)

大肠杆菌Escherichiacoli可导致腹泻，感染某些致病性较强的血清型时还可能致命，因此，被很多国家作为各类食品污染状况的指示菌进行检测，是保障食品安全的重要指标之一(Nyachuba，2010)。牛奶在人类的日常生活饮食结构中的作用和地位不可替代(Bahareh，2010)，牛奶制品在生产加工过程中极易成为微生物的“繁殖基地”，其中大肠杆菌污染较为常见(Riffonetal.，2001)。因此，在牛奶的生产加工过程中需使用消毒剂(马保瑞，2013)。

季铵盐类(quaternary ammonium compounds，QACs)消毒剂是一类高效、低毒的消毒剂，被广泛应用于养殖、食品加工设备与器皿消毒、环境与物体表面消毒等(张卓娜等，2018)。随着消毒剂的不合理使用，研究报道多种细菌对QACs消毒剂产生了耐药性(姜晓冰等，2016；Hanetal.，2019)。目前消毒剂耐药基因主要有5种染色体型耐药基因[sugE(c)、emrE、ydgE、ydgF、mdfA](Edgar &Bibi，1997；Bayetal.，2008)，除mdfA基因属于MFS家族外，sugE(c)、emrE、ydgE和ydgF基因属于SMR家族；5种可移动原件(质粒、整合子或转座子)介导的耐药基因qacE、qacEΔ1、qacF、qacG和sugE(p)属于SMR家族(Ployetal.，1998；Kuckenetal.，2000；Lietal.，2010；郭莉娟等，2014)。鉴于此，本实验检测从奶牛养殖场中分离的牛奶源大肠杆菌对4种QACs消毒剂的最低抑菌浓度(MIC)值，并对10种QACs消毒剂耐药基因进行检测，旨在研究大肠杆菌对QACs消毒剂的耐药现状，为消毒剂正确使用、预防和控制食源性致病菌QACs耐药提供理论依据，对保障食品质量安全也具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

第一次从四川省绵阳市某牧场采集生牛奶样品55个，第二次从四川省成都市青白江区某牧场采集生牛奶样品19个，2次共采样74个。样品采集后装入冰盒中带回实验室24 h内处理完毕。

1.2 仪器与试剂

培养基：缓冲蛋白胨(BPW)、麦康凯(MacConkey broth)、伊红美蓝(EMB)、大豆酪蛋白琼脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、营养琼脂(NA)培养基均由北京陆桥技术有限责任公司生产；水解酪蛋白琼脂(MHA)培养基(Oxoid，英国)。

消毒剂：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、苯扎氯铵(BC)、双十烷基二甲基氯化铵(DDAC)(成都贝斯特试剂有限公司)；氯代十六烷基吡啶(CPC)(成都市科龙化工试剂厂)。质控菌株大肠杆菌(ATCC 10536)由四川农业大学资源学院应用微生物学系馈赠。

1.3 引物设计与合成

消毒剂耐药性基因的10对引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成(表1)。

1.4 菌株的分离

分别取25 mL样品置于500 mL无菌袋中，加入225 mL BPW，剧烈摇晃；取50 mL加入无菌三角烧瓶中，加入50 mL双倍麦康凯液体培养基，35 ℃培养24 h。培养完成后，划线至EMB琼脂平板上，35 ℃培养24 h。挑选EMB平板上典型大肠杆菌菌落划线到TSA平板，最后经革兰氏染色鉴定后，保存至含15%～20%甘油的TSB培养基中，-80 ℃冻存备用(何雪梅等，2014)。大肠杆菌分子鉴定利用16S rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGATACCTTGTTACG-ACTT-3’)进行PCR扩增，并送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，确定该批牛奶样品中大肠杆菌的检出率。

1.5 消毒剂最低抑菌浓度测定

1.5.1 菌悬液与消毒剂平板制备参照药物敏感性实验执行标准(Clinical and Laboratory Standards Institute，2017)测定消毒剂的MIC。蘸取大肠杆菌及质控菌株纯培养物菌液，划线于NA培养基上，37 ℃培养过夜，用棉签蘸取3～5个单菌落加入3 mL 生理盐水中，充分混匀，制备为0.5麦氏浓度的菌悬液，取200 μL菌悬液加到含有1.8 mL无菌生理盐水进行10倍稀释。

表1 季铵盐类消毒剂耐药基因引物及序列Table 1 Primers for quaternary ammonium compounds disinfectant resistance genes

采用二倍稀释法制备消毒剂平板，分别将4种消毒剂稀释到所需的浓度梯度，然后将不同浓度的消毒剂分别定量(2 mL)加入到平皿中，再向平皿中加入18 mL MHA培养基充分混匀，制成含有不同浓度消毒剂(0.125 mg·L-1、0.25 mg·L-1、0.5 mg·L-1、……、1 024 mg·L-1)的MHA培养基平板。每个浓度3个平行组。

1.5.2 接种培养利用多点接种仪接种，吸取上述操作制备好的菌液1 mL置于接种仪配套的玻璃试管中，按消毒剂浓度从低到高的顺序依次放置MHA琼脂平板，菌液依次接种，每接种点细菌数约为1.5×104CFU。接种完后平板正向静置约10 min后倒置于恒温培养箱中，37 ℃培养18～24 h。

1.5.3 MIC值判读培养完成后，将上述MHA平板放置于暗色且不反光的桌面上，仔细观察平板上各接种处的菌斑生长情况，以判断实验终点。以完全不见某细菌生长所对应的消毒剂浓度MHA平板为该消毒剂对该细菌的MIC，对大肠杆菌消毒剂的MIC值进行统计。

1.6 消毒剂抗性基因检测

1.6.1 模板制备采用煮沸法制备模板。将无菌棉签用无菌水润湿，并轻轻刮取NA培养基上生长的3～5个菌落，使菌落完全掉落在有700 μL无菌水的1.5 mL离心管中，煮沸10 min后，13 000 r·min-12 min，上清液即可作PCR模板(何雪梅等，2014)。

NM360衬板具有如下特点：① 强度高，具有高的屈服强度和抗拉强度，对脆性破坏的抗力也极大。② 韧性高，具有优良的低温韧性，因此可在大型焊接结构件和低温环境中使用。③ 优秀的焊接性能，成分设计时极力减低碳含量、碳当量和热敏感系数，以提高焊接性能，因而具有优秀的焊接接头性能。④ 优秀的加工性能，钢板可进行冷加工、弯曲加工和切断加工。气体切断时，即使不预热也不会出现裂缝。进行预热加工时，调质钢需在回火温度以下加工。⑤ 高超的耐磨损、耐腐蚀性，由于含有钼、铬等合金元素，与一般钢材比较，耐腐蚀性良好，硬度也比较高，耐磨损性也良好。

1.6.2 PCR反应体系与循环条件PCR扩增体系：mix 12.5 μL，10 μmo1·L-1的上、下游引物各1 μL，上述制备的DNA模板2.5 μL，无菌去离子水8 μL，总体积25 μL。PCR扩增条件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火温度依照各引物(表1)设定并持续60 s，随后72 ℃ 90 s，30个循环；最后72 ℃ 10 min。

1.6.3 琼脂糖凝胶电泳1%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳槽中加入0.5×Tris-硼酸电泳缓冲液，电压100 V，约30 min后取出成像拍照，保存图片。

1.7 消毒剂耐药基因与MIC值相关性分析

采用SAS 9.4分析消毒剂耐药基因与MIC值之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌分离情况

大肠杆菌在麦康凯培养基上的菌落形态为鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，边缘整齐，表面光滑，在EMB培养基上菌落形态为光滑圆形，有紫色或黑色中心，有金属光泽的菌落特征。74个牛奶样品共检测出45株疑似大肠杆菌，16S rDNA测序结果在NCBI上的BLAST进行序列比对后，最终确认全部为大肠杆菌。该批牛奶样品中大肠杆菌的检出率为60.81%(45/74)。

2.2 消毒剂MIC值测定结果

4种消毒剂对45株牛奶源大肠杆菌的MIC值不同，范围广泛：CTAB、BC、CPC和DDAC对质控菌株ATCC 10536的MIC值分别为128 mg·L-1、16 mg·L-1、64 mg·L-1、4 mg·L-1(表2)。45株大肠杆菌中，CTAB的MIC值为128～512 mg·L-1，其中MIC值为256 mg·L-1的共34株(75.56%)；BC的MIC值为32～256 mg·L-1，其中MIC值为128 mg·L-1的共32株(71.11%)；CPC的MIC值为32～256 mg·L-1，其中MIC值为128 mg·L-1的共18株(40.00%)；DDAC的MIC值为16～128 mg·L-1，其中MIC值为32 mg·L-1的共35株(77.78%)。本次检测中，45株牛奶源大肠杆菌对CTAB、BC及CPC的抑制50%受试菌生长所需MIC值(MIC50)和抑制90%受试菌生长所需MIC值(MIC90)均达到128 mg·L-1以上，且对DDAC更敏感，其MIC50和MIC90分别达到32 mg·L-1和64 mg·L-1(表3)。

2.3 消毒剂耐药基因检测结果

2.3.1 消毒剂耐药基因检出率45株牛奶源大肠杆菌中全部检出携带消毒剂耐药基因，染色体型耐药基因检出率(37.78%～84.44%)均高于质粒型耐药基因(4.44%～33.33%)。其中，基因ydgF(n=38，84.44%)和ydgE(n=36，80.00%)的检出率最高，基因sugE(p)(n=2，4.44%)、qacG(n=5，11.11%)和qacF(n=6，13.33%)的检出率较低(图1)。

表2 大肠杆菌对不同消毒剂的最低抑菌浓度值分布Table 2 Minimum inhibitory concentrations of quaternary ammonium compounds disinfectants on Escherichia coli

表3 大肠杆菌对4种季铵盐类消毒剂的耐受程度Table 3 The tolerance of Escherichia coli to 4 quaternary ammonium compounds disinfectants

图1 45株大肠杆菌消毒剂耐药基因检测Fig.1 Detection of disinfectant resistant genes in 45 Escherichia coli isolates

2.3.2 消毒剂耐药基因组合根据大肠杆菌携带消毒剂耐药基因的不同，将45株大肠杆菌携带的消毒剂耐药基因分为33种不同组合(表4)，耐药基因组合最少的有1种，最多的共8种，检测出3种及3种以上的耐药基因菌株有37株，占82.22%。检出耐药基因组合占比为2.22%～8.89%，其中，检出耐药基因菌株数最多的组合为ydgE-ydgF-sugE(c)(n=4，8.89%)，其次为mdfA-ydgE-ydgF-sugE(c)(n=3，6.67%)和mdfA-ydgE-ydgF-emrE-sugE(c)(n=3，6.67%)。检出耐药基因菌株数最多的组合中的4种菌株对5种消毒剂的MIC值均高于标准菌株，并显示出对这5种消毒剂为较高水平耐药。

2.4 消毒剂耐药基因与MIC值相关性

相关性分析发现，大肠杆菌消毒剂基因qacF与128 mg·L-1的CPC之间的差异有统计学意义(P<0.05)；未发现其他耐药基因与MIC值之间差异性。但分析消毒剂耐药基因组合与MIC值之间的关系发现，耐药基因组合为5种及5种以上的大肠杆菌中，CTAB的MIC90为512 mg·L-1的菌株占31.25%(5/16)；耐药基因组合为4种及4种以上的菌株中，CPC的MIC90为256 mg·L-1的菌株占29.63%(8/27)。

表4 45株大肠杆菌中消毒剂耐药基因分布情况Table 4 Distribution of disinfectant resistant genes in 45 Escherichia coli isolates

3 讨论

3.1 牛奶中大肠杆菌污染情况

本研究中45株大肠杆菌均分离于牧场健康奶牛牛奶样品，分离率为60.81%。Ombarak等(2016)调查埃及被大肠杆菌污染原料乳及其产品中获得了222株大肠杆菌，而其他喜食牛奶的国家也曾不同程度地爆发过受致病菌污染而导致的牛奶源疾病(冯疆蓉，李春杰，2016)。付宇等(2016)在采集的110份牛奶样品中共分离出大肠杆菌59株，检出率为53.6%(59/110)。黄梦夏等(2018)采集牛奶样本26份，鉴定出大肠杆菌6株，检出率为23.1%(6/26)。牛春晖等(2018)从采集牛奶样本中获得的大肠杆菌分离率高达100%。一般情况下，牛奶中大肠杆菌主要来源于患病泌乳牛病原菌的感染，这与奶牛生活环境及挤奶室环境有很大关系(冯疆蓉，2017)。

3.2 牛奶中大肠杆菌对消毒剂的耐药性

45株大肠杆菌对4种消毒剂的MIC值检测结果均不相同，其中，CTAB的MIC值最高(128～512 mg·L-1)，明显高于其他3种消毒剂，这与Schwaiger等(2014)对肠球菌Enterococcus的季铵盐类消毒剂耐药性研究的结果一致。目前对于细菌对消毒剂耐药性的判定依据尚无定论。较多研究者以药物敏感性实验实际测得的菌株MIC值与所用标准菌株在相同环境下的MIC值比较来判定该菌株的耐药性(常帅，2013)。某细菌在消毒剂作用下的MIC值超过标准菌株时，则认为该细菌对该消毒剂具有耐药性。本研究中大肠杆菌对BC和DDAC的MIC值均高于质控标准菌株，少数菌株对CTAB和CPC的MIC值与标准菌株的相同，但多数菌株对这2种消毒剂的MIC值仍较高。另外，大肠杆菌对研究中4种消毒剂的MIC50和MIC90都较高，其中，CTAB、BC和CPC的MIC50和MIC90均在128 mg·L-1以上。由此可见，与抗生素滥用后造成的影响一样，消毒剂的广泛使用也会对大肠杆菌产生选择作用，造成大肠杆菌的耐药性。何雪梅等(2014)对猪肉源大肠杆菌消毒剂的耐药性研究表明，大肠杆菌对QACs消毒剂的MIC值普遍较高，且比标准菌株的有明显升高，与本实验结果一致。

大肠杆菌消毒剂耐药性产生的原因主要是消毒剂的使用剂量不足，以及不科学的使用范围。大量动物源细菌耐药性的研究发现，细菌的耐药率与养殖场抗菌药的使用剂量、频率存在很强的相关性(潘志明等，2002；宋立等，2009)。不合理的操作使消毒剂对其原本可以杀灭的细菌不能起到杀灭作用，当长期处于这种无效药物作用的环境下，便强化了细菌对该类药物的适应性，从而增加了消毒剂耐药性的产生概率。

3.3 牛奶中大肠杆菌消毒剂耐药基因情况

本研究的消毒剂抗性基因包括mdfA、ydgE/F、emrE和sugE(c)5种染色体编码基因，以及qacE、qacF、qacEΔ1、qacG和sugE(p)5种质粒介导的抗性基因。这些染色体编码基因能特异性地介导对QACs消毒剂的耐药性，且研究表明它们可以在大肠杆菌中垂直传播(Bay &Turner，2009)。同样，当环境中拥有质粒、整合子或者转座子等可移动元件介导的抗性基因，如qacE、qacEΔ1等，细菌就有可能通过可移动元件获得这些抗性基因，从而增加该环境中细菌消毒剂抗性基因的携带率。目前已有报道的消毒剂抗性基因除上述10种外，还有很多属于qac家族亚型的基因，比如qacA、qacB、qacC、qacH和qacI等，其中已有研究在大肠杆菌等革兰氏阴性细菌中发现qacH、qacI基因(Polyetal.，1998；Kuckenetal.，2000；Lietal.，2010)。这些抗性基因中只有mdfA基因属于MFS家族，其余基因均通过编码外排泵蛋白赋予对QACs消毒剂的耐药性，因而均在SMR蛋白家族中(Bayetal.，2008)。赵凯丽和李武平(2016)在研究微生物消毒剂抗性产生机制时发现，大肠杆菌可以利用外排泵增加消毒剂向胞外的主动排出从而对消毒剂产生抗性，对大肠杆菌所含抗性基因进行检测显示，无论是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌中均有外排泵基因检出的情况。Smith等(2008)发现，qac家族基因检出的阳性菌株与阴性菌株对QACs消毒剂的MICs存在显著差异，其中携带qac家族基因菌株的MIC值可为不携带该家族基因的2倍。

本研究所检测的10种消毒剂抗性基因均为阳性，消毒剂染色体型耐药基因检出率(37.78%～84.44%)较质粒型耐药基因检出率(4.44%～33.33%)高，基因ydgF(n=38，84.44%)和ydgE(n=36，80.00%)最高。同时，质粒型耐药基因中检出率最高的是qacEΔ1(n=15，33.33%)，其次是qacE(n=8，17.78%)。qacEΔ1基因为qacE基因的缺失型，本研究中牛奶源大肠杆菌中qacEΔ1基因检出率较其他质粒型基因高。宋红梅等(2013)对生活用水中总大肠菌群中耐药基因研究中，大肠杆菌qacEΔ1基因检出率(45.5%)也较高。由此可见，qacEΔ1基因很可能在细菌之间广泛传播，应当引起重视。

本研究所检测的耐药基因在45株牛奶源大肠杆菌中均被检出，且耐药基因组合较丰富(共检出33种)，且检测基因组合越多，菌株的MIC值越高。说明牛奶源大肠杆菌携带消毒剂抗性基因的概率很高。严重的是，某些细菌由于长期暴露在QACs消毒剂亚抑菌浓度下，不仅产生对消毒剂的耐药性，还可能出现传播时交叉耐药现象，比如可能导致消毒剂与抗生素产生共耐药机制(Soumetetal.，2012；杨盛智等，2016)，给临床疾病治疗上抗生素的使用带来更大的挑战。