家鸡GPR15基因的克隆、功能探究及组织表达分析

方超， 张剑南， 李枭虓， 陈军安， 李娟， 王亚军

(四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065)

人Homosapiens的G蛋白偶联受体15(G protein-coupling receptor 15，GPR15)于1996年被首次克隆(Heiberetal.，1996)，研究表明GPR15在哺乳动物中调节多种生理功能：在小鼠Musmusculus大肠T细胞中，GPR15通过介导上皮中T细胞归巢调节免疫反应，参与调控调节性T细胞(Treg cells)抑制非感染性炎症，对预防大肠病理性炎症至关重要(Kimetal.，2013；Nguyenetal.，2015)；在小鼠皮肤淋巴细胞归巢中，GPR15有助于淋巴细胞靶向不同的上皮部位(Lahletal.，2014)；GPR15还参与先天性免疫调节，并与多种疾病存在密切关联，如克罗恩病和类风湿性关节炎(Cartwrightetal.，2014)；GPR15在吸烟者体内高表达亦暗示其可能参与调控吸烟引起的疾病(Koks & Koks， 2017)。除了炎症反应之外，肠道微生物菌群可以影响小鼠GPR15的表达水平，暗示GPR15可能参与调控肠道的微生物菌群稳态平衡(Kimetal.，2013)。GPR15调节的生理功能与其在组织中的特异性表达图谱密切相关，人类组织转录组测序数据表明GPR15在淋巴细胞中具有最高的表达丰度，表明其在免疫反应中的重要作用，其次高表达于结肠和小肠中，表明GPR15可参与调节肠道稳态(Koks & Koks，2017)。

因为GPR15是孤儿受体，故人们致力于寻找其内源性配体。最新研究报道人类C10ORF99基因编码GPR15的内源性配体蛋白GPR15L，可以激活GPR15并抑制毛喉素(forskolin)诱导的环腺苷酸(cAMP)产生(Suplyetal.，2017)。Ocon等(2017)的研究表明人类C10ORF99基因和小鼠2610528A11Rik基因可编码GPR15L，并鉴定其可作为一种淋巴细胞趋化因子，通过激活GPR15发挥功能。但我们发现GPR15L基因在非哺乳类脊椎动物中消失，因此，在鸟类等非哺乳动物类群中，GPR15的配体仍待鉴定。因GPR15与爱帕琳肽受体(APLNR)和GPR25具有较高的结构相似性(Leeetal.，2001)，提示APLNR (Chngetal.，2013；Paulietal.，2014)和GPR25 (Zhangetal.，2018)的配体Apelin和Apela也可能会作为GPR15的潜在配体，但该假设有待验证。

目前，关于GPR15的研究主要集中在哺乳动物中，在其他脊椎动物类群中的研究几属空白。鉴于GPR15在哺乳动物炎症反应和肠道稳态中的重要调控作用(Kimetal.，2013；Koks & Koks，2017)，本研究以家鸡Gallusgallusdomesticus为模型，首次针对GPR15的基因结构、功能和表达特征进行了探究，以期为探究GPR15在非哺乳类脊椎动物中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗曼粉蛋鸡购于成都牧星种鸡场，本实验室提供大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞。真核表达载体pcDNA3.1(+)购于美国Invitrogen公司，斑马鱼DaniorerioGPR25真核表达质粒保存于本实验室(Zhangetal.，2018)。RNAzol购于美国Molecular Research Center公司；限制性内切酶、RNA反转录酶M-MLV及其配用体系购于TaKaRa公司；高保真聚合酶KOD及其配用体系购于日本TOYOBO公司；Easy Taq酶及其配用体系购于全式金公司；引物合成及后续测序工作由成都擎科生物技术有限公司完成；DMEM低糖培养基购于GIBCO公司；转染试剂JetPEI购于Polyplus-transfection公司；5×细胞裂解液(5×Passive Lysis Buffer)和荧光素酶报告系统购于Promega公司。家鸡Apelin多肽(TPLRQNPARAGRSQRPAGWRRRRPRPRLSHKGPMPF)和Apela多肽(LVRPRGARRGNVRRPGGWRRLRRP-RPRLSHKGPMPF)由上海吉尔生化公司合成。

1.2 方法

1.2.1家鸡组织总RNA的提取分别取家鸡不同组织样品(盲肠、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、卵巢、精巢、大脑、小脑)于液氮中充分研磨至粉末，将60 mg磨碎组织加入到600 μL RNAzol中涡旋混匀；加入240 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)灭菌水后涡旋混匀，于4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min；取上清，加入3 μL阿司咪唑(BAN)后涡旋混匀，于4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min；吸取上清液，加入等体积的异丙醇，涡旋混匀后于-20 ℃静置20 min，于4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min；吸弃上清，用70%乙醇漂洗沉淀，于4 ℃、12 000 r·min-1离心3 min，重复该操作一次，吸弃上清；用20 μL DEPC-H2O溶解RNA沉淀，并储存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2cDNA模板制备以家鸡组织总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书操作。配制混合液1：RNA 2 μg和Olig-dT 1 μL，加入DEPC-H2O补足5 μL，于PCR仪中70 ℃反应10 min，取出静置于冰上10 min。配制混合液2：5×Buffer 2 μL、dNTP 1 μL和M-MLV反转录酶0.5 μL，加入DEPC-H2O补足5 μL；将混合液1与混合液2混匀，然后放入PCR仪中，42 ℃反应1.5 h，70 ℃反应10 min，取终产物加入70 μL灭菌水后存于-20 ℃中，即为cDNA模板。

1.2.3家鸡GPR15的引物设计及扩增根据Ensembl数据库(http：//www.ensembl.org)中检索得到的家鸡GPR15的预测序列(登录号：XM_004938212)，设计了用于克隆其cDNA序列的引物GPR15 F1/GPR15 R1，并且设计用于检测GPR15在组织表达图谱的实时定量PCR引物(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

PCR反应以家鸡盲肠来源的cDNA为模板。PCR反应体系按照KOD酶说明书配制，体系如下：5 μL 2×KOD缓冲液，2 μL盲肠cDNA模板，2 μL dNTPs，上、下游引物各0.1 μL，0.5 μL KOD-Fx聚合酶，0.3 μL去离子灭菌水。PCR反应程序为：94 ℃2 min；98 ℃10 s，60 ℃30 s，68 ℃90 s，35个循环；72 ℃20 min，12 ℃保存。经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化后的PCR产物连接至pcDNA3.1(+)载体，通过序列测定，确定GPR15的cDNA序列。

1.2.4细胞转染及荧光素酶活性测定待培养细胞密度至60%左右进行质粒转染。转染体系为：受体基因表达载体或pcDNA3.1(+)空载体200 ng/孔；荧光素酶报告质粒800 ng/孔；转染试剂JetPEI 2 μL/孔；用转染缓冲液配成总体系为100 μL的混合液，室温放置10 min后，将转染混合液加入到 6孔板中，4 h后更换培养基。配体(多肽或药物)处理前，用胰蛋白酶液消化细胞，再将HEK293细胞传代至96 孔板中，置于5%浓度CO2的37 ℃恒温培养箱培养24 h后进行配体处理。配体处理时，按照10-12～10-5mol·L-1配制，处理6 h后，使用1×Passive Lysis Buffer充分裂解细胞，加入Luciferase底物后，在酶标仪中测定荧光素酶活性。具体方法参见Mo等(2017)和Zhang等(2018)，实验数据使用GraphPad Prism 7进行分析处理。

1.2.5GPR15表达图谱分析通过实时定量PCR(qPCR)技术，以家鸡不同组织(盲肠、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、卵巢、精巢、大脑、小脑)的cDNA为模板，检测GPR15基因的表达水平。PCR反应程序为：94 ℃2 min；98 ℃10 s，60 ℃20 s，68 ℃15 s，40个循环；72 ℃20 min，PCR产物由成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，具体方法参见祝国强等(2017)和邓秋洋等(2018)。同时利用转录组数据分析GPR15基因的组织表达。RNA-seq数据下载于NCBI数据库(登录号：PRJEB4677)，该实验在1只雄性和1只雌性成年红原鸡Gallusgallus中共取得27个组织，包括脂肪、肾上腺、胸肌、小脑、大脑、心脏、下丘脑、肾脏、肝脏、肺、卵巢、腺胃、坐骨神经、脾脏和精巢等，之后利用Salmon(v0.82)对RNA-seq数据进行转录本的定量(Patroetal.，2017)分析，TPM(transcripts per million)值表示转录本丰度，使用GraphPad Prism 7绘制图片。

1.2.6生物信息学分析采用SeqMan和EditSeq进行测序结果序列拼接，用DNAMAN进行DNA和蛋白质序列比对，使用CFX Manager进行qPCR数据定量分析；通过SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org/)网站进行蛋白三维结构同源建模，使用MEGA 7进行系统发育分析，采用邻接法(neighbor-joining method)，重复计算引导值(bootstrap values)达1 000次。

2 结果与分析

2.1 家鸡GPR15基因的克隆及序列分析

根据家鸡GPR15的预测序列(登录号：XM_004938212)，设计引物GPR15 F1/R1。以家鸡盲肠cDNA为模板进行PCR扩增，测序获得家鸡GPR15基因的cDNA序列(登录号：MH293603)。序列分析表明：家鸡GPR15基因编码区cDNA序列长度为1 107 bp，含1个外显子，编码含368个氨基酸的受体蛋白(图1：A)。家鸡GPR15是具有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体(图1：B、C)。家鸡GPR15具有保守的GPCR结构特征：包括维持GPR15三维结构的二硫键(Cys113～Cys190)、参与受体激活和G蛋白偶联信号转导的保守“DRY”基序(位于第二胞内域)以及“NP(XX)Y”基序(位于第七跨膜区)。通过同源建模方法，本研究模拟了家鸡GPR15的三维结构，可观察到经典的7次跨膜结构域，并预测其在C端具有1个α-螺旋结构(图1：C)。

2.2 多物种GPR15的氨基酸序列比对

多物种氨基酸序列比对表明(图2)：家鸡GPR15分别与人、北美绿蜥蜴Anoliscarolinensis、小鼠GPR15具有中度的氨基酸序列一致性，分别为56.2%、55.9%、55.7%；与斑点雀鳝LepisosteusoculatusGPR15的氨基酸序列相似度相对较低，为35.2%。

图2 家鸡Gallus gallus domesticus GPR15与人Homo sapiens、北美绿蜥蜴Anolis carolinensis、小鼠Mus musculus、斑点雀鳝Lepisosteus oculatus GPR15的氨基酸比对Fig. 2 Amino acid sequence alignment of Gallus gallus domesticus GPR15 with that of Homo sapiens， Anolis carolinensis，Mus musculus， and Lepisosteus oculatus

2.3 GPR15系统进化分析及功能探究

GPR15基因位于家鸡1号染色体上。选取斑胸草雀Taeniopygiaguttata、中华草龟Chinemysreevesii、北美绿蜥蜴、人和家鸡的GPR15基因进行共线性分析。结果表明，家鸡GPR15基因与斑胸草雀、中华草龟、北美绿蜥蜴、人的GPR15基因为直系同源基因(图3)。

由于有研究报道GPR15与GPR25、APLNR受体有序列相似性，因此，本研究对GPR15、GPR25、APLNR、AGTR1、AGTR2等基因进行系统进化分析。聚类分析表明(图4)，多个脊椎动物的GPR15、GPR25和APLNR基因可形成一个大的分支，并且GPR15还与GPR25形成一个小分支。这些结果提示GPR15与GPR25有较近的进化关系。在近期研究中，发现孤儿受体GPR25可被APLNR的配体Apelin和Apela多肽激活(Zhangetal.，2018)。据此，假设“Apelin和Apela或是GPR15的潜在配体”。

图3 家鸡Gallus gallus domesticus、斑胸草雀Taeniopygiaguttata、中华草龟Chinemys reevesii、北美绿蜥蜴Anoliscarolinensis和人Homo sapiens GPR15基因的共线性分析Fig. 3 Synteny analysis of GPR15 gene among Gallus gallus domesticus， Taeniopygia guttata， Chinemys reevesii，Anolis carolinensis and Homo sapiens

为验证上述假设，本研究采用了pGL3-CRE-luciferase报告系统(Moetal.，2017；Zhangetal.，2018)，探究Apelin和Apela多肽(10-12～10-5mol·L-1，6 h)对表达于HEK293细胞中的家鸡GPR15(cGPR15)的激活效应。家鸡Apelin和Apela多肽不能激活家鸡GPR15受体，从而无法影响forskolin(5 μmol·L-1)刺激的HEK293细胞的荧光素酶活性(图5：A)。相反，在相同实验条件下，家鸡Apelin和Apela多肽可以剂量依赖地激活斑马鱼GPR25(zfGPR25)，抑制forskolin刺激的荧光素酶活性(图5：B)(Zhangetal.，2018)。采用pGL4-SRE-luciferase报告系统(Moetal.，2017)也发现家鸡Apelin和Apela多肽不能激活家鸡GPR15(图5：C)。上述结果暗示，与GPR25和APLNR不同(Chngetal.，2013； Paulietal.，2014； Zhangetal.，2018)，GPR15不能被Apelin和Apela肽激活。

图4 脊椎动物中G蛋白偶联受体A家族的系统进化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of class A GPCR family among vertebrates

图5 家鸡Gallus gallus domesticus GPR15的功能分析Fig. 5 Functional analysis of Gallus gallus domesticus GPR15 in cultured HEK293 cells by cell-based luciferase reporter system

2.4 GPR15的组织表达图谱

采用qPCR检测GPR15基因在家鸡盲肠、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、卵巢、精巢、大脑和小脑中的表达分布情况(图6：A)，以肺中的表达水平为参照，GPR15基因相对高表达于脾脏中，而在盲肠和肺中有中等水平表达，在心脏、肝脏、肾脏、卵巢、精巢、小脑和大脑中，仅检测到微弱表达。与qPCR结果高度类似，转录组数据分析(图6：B)也揭示GPR15基因高表达于家鸡祖先红原鸡脾脏中，在肺中中等表达，而在卵巢、精巢、坐骨神经等组织中微弱表达。

图6 鸡GPR15基因的组织表达图谱分析Fig. 6 Tissue expression of chicken GPR15 gene

3 讨论

GPR15作为G蛋白偶联受体家族成员备受关注。已有研究表明在小鼠中，GPR15可介导肠道稳态并参与调控肠道炎症反应(Kimetal.，2013)。鉴于GPR15的重要生理功能，本研究首次从家鸡中成功克隆到GPR15基因，并尝试寻找其内源性配体，揭示其组织表达特征，为阐释GPR15在禽类免疫和肠道稳态中的生理作用奠定基础。

本研究首先克隆了家鸡GPR15基因，发现其编码区序列全长为1 107 bp，含1个外显子，编码含368个氨基酸的受体蛋白。家鸡GPR15也具7次跨膜结构域，其氨基酸序列与人、北美绿蜥蜴、小鼠具有约56%氨基酸序列一致性；共线性分析表明家鸡GPR15基因是人GPR15基因的直系同源基因。系统进化分析显示GPR15与GPR25和APLNR有较近的进化关系。尽管有研究发现小鼠和人GPR15L基因可以编码GPR15的配体(Suplyetal.，2017)，但是GPR15L基因在非哺乳类脊椎动物中似乎已消失，因此，在包括家鸡在内的非哺乳动物中，GPR15的配体仍待鉴定。同时，本研究小组最新研究结果表明，APLNR内源性配体Apelin和Apela肽可以激活GPR25(Zhangetal.，2018)。鉴于GPR15与GPR25具有较近的进化关系，亦初步探究了Apelin和Apela对家鸡GPR15的激活效应。结果表明Apelin和Apela不能激活表达于HEK293细胞中的家鸡GPR15，而在相同实验条件下，Apelin和Apela可以激活斑马鱼GPR25。因此，在非哺乳类脊椎动物中，GPR15的功能和内源性配体仍待鉴定。

qPCR分析发现，家鸡GPR15基因在脾脏中表达丰度最高，其次是盲肠、肺等。这与哺乳动物中的发现基本一致，如GPR15在人淋巴细胞中具有最高的表达水平，其次高表达于结肠和小肠等组织(Koks & Koks， 2017)，在脾脏亦能检测到较高的表达水平(Dengetal.，1997)。Western blot检测到GPR15蛋白可在人睾丸和肝脏中表达，而在大脑、胎盘、肺、子宫、心脏、胰腺或骨骼肌中无表达(Claytonetal.，2001)。在小鼠中，脾脏GPR15可与血栓调节素相互作用缓解败血症(Panetal.，2017)。GPR15在家鸡脾脏中的高表达，提示其可能参与脾脏中的免疫反应。家鸡GPR15在盲肠组织中的表达结果与哺乳动物中的发现也一致(Dengetal.，1997)。在小鼠中，广谱抗生素治疗可降低肠道GPR15的表达量，推测GPR15可能在平衡肠道微生物菌群中发挥作用(Kimetal.，2013)，至于GPR15是否在家鸡盲肠中发挥类似效应，值得关注和深入研究。