2种麻醉剂对红耳龟麻醉时效及听力的影响

雷金洪，王同亮，钟香香，简彤，杨昌玉，史海涛，汪继超

（热带岛屿生态学教育部重点实验室，海南省热带动植物生态学重点实验室，海南师范大学生命科学学院，海口571158）

麻醉是开展电生理实验的重要环节之一，麻醉剂的种类及其剂量对实验效果产生较大影响。目前常用的麻醉剂分为2类：吸入性麻醉剂和非吸入性麻醉剂（李丹等，2017；王丹等，2021）。常用的吸入性麻醉药有乙醚、氟烷、氯仿、甲氧氟烷、地氟醚和异氟醚等（Mongo & Vassort，1990；姜龙等，2014；Gentili，2020；Whiteet al.，2021）；常用的非吸入性麻醉剂为水合氯醛和戊巴比妥钠等（Yana‑gawaet al.，2016；肖美等，2020；Reimeret al.，2020；刘燕等，2021）。吸入性麻醉能较好的控制麻醉深度，使被麻醉对象快速进入麻醉状态，且苏醒迅速、平稳（李钰等，2014），但该类麻醉剂价格相对昂贵、易挥发、可引起动物喉痉挛（胡雄飞等，2020；王丹等，2021）；非吸入性麻醉操作简单，可通过皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、口服及直肠灌注等方式对动物进行麻醉，具有较好的麻醉效果（孙乐天，穆晓丽，2011；姜龙等，2014；彭浩，赵妮妮，2016；Reynoldset al.，2016；保明伟等，2020）。麻醉诱导时间和麻醉持续时间是评价麻醉效果的重要指标（Wixsonet al.，1987；Roderet al.，1993；Wadaet al.，1995；李少春等，2014；Caoet al.，2016；胡雄飞等，2020）。麻醉诱导时间短可使动物迅速进入麻醉状态；麻醉持续时间长可减少或消除动物疼痛，符合动物福利要求（胡雄飞等，2020）。不同麻醉剂对同一动物的麻醉效果不同，且同一麻醉剂对不同动物类群的麻醉效果也存在较大差异。因此，麻醉剂选取需综合考虑麻醉对象、麻醉时效、实验需求等因素。

听觉是动物进行声音通讯的必要环节，敏感的听觉有利于提高声音通讯效率。听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）是一种通过记录听觉诱发电位来反映动物听力敏感性的电生理测试方法（Tsubokawaet al.，1980；Greenberg，2007；Zaitounet al.，2017）。该方法主要测定动物的可听范围、ABR阈值、反应时间等指标，其中可听范围宽、ABR阈值低、反应时间短，表明动物的听觉越敏感。目前，该方法因具有无损伤、准确、快速等优点，被广泛用于鱼类、两栖类、爬行类、哺乳类等动物的听力敏感性研究（Corwinet al.，1982；Ken‑yonet al.，1998；Brittan-Powellet al.，2010；Wolfet al.，2017；Wanget al.，2019；Teubenbacheret al.，

2020）。采用该方法测定听力时，需对动物进行深度麻醉。不同的麻醉剂可导致听觉测定结果产生差异，且同一麻醉剂及其剂量对不同动物类群听力测定也产生较大影响（Looijet al.，2004；Rueb‑hausenet al.，2012；Carrascoet al.，2019）。因此，在开展动物听力研究过程中需选择合适的麻醉剂及其剂量。

龟类是现生爬行动物中的古老类群（Clack，1997）。与其他动物类群相比，龟类听觉的可听范围相对较窄（通常小于1 kHz）。龟类听力的相关研究中常采用戊巴比妥钠对动物进行麻醉（Heardet al.，2001；Wanget al.，2019），目前因管控提升，该药物开始限制使用。因此，需选取和评估其他麻醉剂对龟类的麻醉效果及其对听力敏感性的影响。水合氯醛是一种常用的非吸入性麻醉剂，小剂量可镇静、中剂量可催眠、大剂量可引起昏迷和麻醉（徐平，2007；周洁等，2010）。水合氯醛适用于心肌功能试验、电生理试验（周昆，屈彩芹，2008；Valenzuelaet al.，2016），被认为是一种安全、有效的麻醉剂（Reich & Wiatrak，1996；Valenzuelaet al.，2016；Fonget al.，2021）。目前尚无相关研究评估水合氯醛对龟类的麻醉效果及其用于该类群听觉研究的可行性。本研究选取了成体雌性和雄性红耳龟Trachemys scripta elegans作为研究对象，通过比较麻醉起效时间、维持时间及可听范围、ABR阈值、反应时间，评估了2种麻醉剂对红耳龟的麻醉效果和听力的影响。研究结果将为龟鳖动物的麻醉及听力的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2021年6月13日从海口文昌龟鳖养殖专业合作社购置雌性（体质量：911.39 g±61.37 g，n=16）和雄性（体质量：871.06 g±76.64 g，n=16）红耳龟，置于海南师范大学生态园龟鳖养殖池（长200 cm×宽100 cm×高25 cm）驯化。饲养过程中每隔3 d投放足量鳄龟粮（5#，海豚水族有限公司）1次，当日取出剩余食物，清洗养殖池并换水。驯化1周，期间环境温度29~31℃。实验时将红耳龟随机分成4组，每组8只：A组为注射水合氯醛雄性，B组为注射水合氯醛雌性，C组为注射戊巴比妥钠雄性，D组为注射戊巴比妥钠雌性。动物个体处于深度麻醉状态时，进行后续电生理实验。动物处于深度麻醉状态的判断方法：注射麻醉剂30 min后，采用镊子轻轻刺激动物的后肢肌肉和眼角膜无明显反应。如果动物尚未处于深度麻醉状态，则按照首次注射剂量的20%进行补加注射（Wanget al.，2019）。实验结束后，将实验动物置于水桶中（未加水），并在龟的背甲上覆盖湿抹布，待实验动物清醒后，置于养殖池中饲养。实验动物处理程序已获得海南师范大学海南省生态环境教育中心实验动物伦理委员会的批准（HNECEE-2018-001）。

1.2 动物麻醉

选取水合氯醛（CAS No.：302-17-0；天津市大茂化学试剂厂，天津）和戊巴比妥钠（CAS No.：57-33-0；山东西亚化学工业有限公司，山东）为麻醉剂，研究这2种麻醉剂对红耳龟的麻醉时效。麻醉剂的配置及剂量如下：将0.10 g戊巴比妥钠加入20.00 mL生理盐水中，配制成0.5%的混合溶液，实验前测量红耳龟的体质量，按照3.00 mL·kg−1的剂量，注射到实验对象的后肢肌肉中（Wanget al.，2019）。将0.50 g水合氯醛加入10.00 mL蒸馏水中，配置成5%的混合溶液，按照6.00 mL·kg−1的剂量，注射到实验对象的腹腔内。水合氯醛的浓度和剂量为本课题组前期经大量实验确定，该浓度和剂量对红耳龟具有较好的麻醉效果，且个体清醒后能够长期正常存活。为保证麻醉效果，实验过程中麻醉剂现配现用。

1.3 麻醉时效指标

本研究采用麻醉起效时间和麻醉维持时间评价2种麻醉剂的麻醉时效。麻醉起效时间是指从注射麻醉剂开始到动物刚进入深度麻醉状态（无明显角膜反应）的时间。麻醉维持时间是指从动物刚进入深度麻醉状态开始到动物开始具有明显角膜反应的时间。

1.4 ABR测试

ABR测试系统主要包括神经生理工作站（RZ6 Multi-I/O Processor；Tucker-Davis Technolo‑gies，Alachua，FL，USA）、前 置放大器（RA4PA；Tucker-Davis Technologies，Alachua，FL，USA）及低阻抗数字探头（TDT RA4LI；Tucker-Davis Technolo‑gies，Alachua，FL，USA）。设备的连接、参数设置、校准、声音信号刺激的产生和呈现参考Wang等（2019）的研究。实验过程中测定纯音刺激和点刺激2种类型的声音刺激下红耳龟的听力敏感性。纯音刺激的刺激频率为0.2~1.5 kHz，每个频率的刺激时间长度为9 ms，2 ms上升/下降，采样频率为24 414 Hz，声压从35 dB 到90 dB，以5 dB 的间隔递增。点刺激的刺激时长为0.1 ms，其中249 ms 的刺激间隔，声压从35 dB 到90 dB，以5 dB 的间隔递增。刺激频率4 次/s。每个ABR 波形叠加200次。ABR 阈值的确定方法：同一频率下不同声强对应的所有ABR 波形图中，通过视觉检测可重复的波形，所有可重复的波形中所对应的最低声压级，即为ABR 阈值。反应时间是指在ABR 波形图中，声压为75 dB 时第一个出现的波谷对应的时间。实验期间，温度29~31 ℃，湿度66%~72%。

1.5 数据统计分析

采用Excel 和SPSS 20.0 进行数据处理和统计分析。所有数据均经正态分布（Kolmogorov-Smirnov test）和方差齐性检验（Levene test）。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）分析不同组间麻醉起效时间及麻醉维持时间的差异显著性；采用独立样本t检验分析不同组别ABR 阈值及反应时间的差异显著性。显著水平设置为α=0.05。数据以±SD表示。

2 结果

2.1 2种麻醉剂对红耳龟麻醉效果的影响

水合氯醛的麻醉起效时间（雄性：65.75 min±4.09 min；雌性：66.25 min±3.27 min）和维持时间（雄性：409.13 min±10.04 min；雌性：403.52 min±11.77 min）在两性间均无显著差异（P>0.05）；戊巴比妥钠的麻醉起效时间（雄性：32.38 min±3.24 min；雌性：31.88 min±2.52 min）和维持时间（雄性：182.63 min±5.98 min；雌性：184.13 min±6.45 min）在两性间也均无显著差异（P>0.05），但水合氯醛的麻醉起效时间（66.00 min±3.71 min）和维持时间（406.44 min±11.32 min）均显著长于戊巴比妥钠的麻醉起效时间（32.13 min±2.91 min）和维持时间（183.38 min±6.26 min）（P<0.05）。

2.2 2种麻醉剂对红耳龟可听范围的影响

红耳龟听力阈值呈U 型，可听范围为0.2~1.2 kHz，在0.5~0.7 kHz最敏感（图1）。

2.3 2种麻醉剂对红耳龟听觉阈值的影响

在可听范围内，2 种麻醉剂对雄性红耳龟的ABR 阈值影响无显著差异（P>0.05；图1：A）。雌性在 0.6~1.2 kHz 范围内，B 组高于 D 组，但差异不显著（P>0.05；图1：B）。

图1 2种麻醉剂对雄性（A）和雌性（B）红耳龟听力阈值的比较Fig. 1 Comparison of hearing threshold of 2 anesthetics in male（A）and female（B）Trachemys scripta elegans

2.4 2种麻醉剂对红耳龟听觉反应时间的影响

A 组在0.7~1.2 kHz 范围内的反应时间高于C 组，但差异不显著（P>0.05；图2：A）；B 组在0.3~0.8 kHz 范围内的反应时间高于D 组，但差异不显著（P>0.05；图2：B）。

图2 2种麻醉剂对雄性（A）和雌性（B）红耳龟反应时间的比较Fig. 2 Comparison of latency of 2 anesthetics to male（A）and female（B）Trachemys scripta elegans

3 讨论

合理有效的麻醉剂及其剂量有助于保障实验结果的可靠性，也是实验动物福利的要求（Zurloet al.，1996；孙安会等，2016；李丹等，2017）。大量研究评估了戊巴比妥钠和水合氯醛对动物的麻醉效果，并得到了不同的研究结论。杨亚南等（2018）发现，按体质量 400 mg·kg−1、40 mg·kg−1分别腹腔注射10%水合氯醛和2%戊巴比妥钠后，水合氯醛组Wistar 大鼠Rattus norvegicus的麻醉起效时间（6.2 min±1.2 min）和维持时间（106.6 min±5.2 min）显著低于戊巴比妥钠组的麻醉起效时间（11.9 min±1.5 min）和维持时间（123.4 min±8.8 min），说明戊巴比妥钠对Wistar 大鼠的麻醉效果更好，这与Schulz 等（2004）和李贻奎（2012）的研究结果一致。陈红燕等（2017）发现，与腹腔注射2%戊巴比妥钠（45 mg·kg−1）相比，10%水合氯醛（350 mg·kg−1）麻 醉 SD 大 鼠的起效 时间更短，深度麻醉时间适当，且首次麻醉成功率更高，方法更简便。相关研究结果（Fieldet al.，1993；程晓峰等，2005；蒋文臣等，2014；钟渝，孙丹宁，2014）也支持这一结论。杨悦等（2012）和Ganigara等（2019）认为，这2种麻醉剂的麻醉效果并无明显差异。本研究发现，与戊巴比妥钠相比，腹腔注射水合氯醛麻醉起效时间（66.00 min±3.71 min）和维持时间（406.44 min±11.32 min）均较长。麻醉起效时间和维持时间明显大于先前啮齿类动物中的相关研究结果。因此，水合氯醛（5%、300 mg·kg−1）和戊巴比妥钠对红耳龟均具有较好的麻醉效果。戊巴比妥钠具有更短的麻醉起效时间，而水合氯醛能够维持更长时间的麻醉状态。

由于麻醉剂和剂量对脑干神经元的反应特性具有显著的调节作用，因此麻醉剂的类型和剂量可能影响动物听力的测定（Carrascoet al.，2019）。研究发现，与清醒状态相比，氯胺酮/甲苯噻嗪导致动物听觉反应时间显著增加，听觉阈值显著升高（Smith & Mills，1991；Looijet al.，2004）；采用异氟醚麻醉小鼠Mus musculus的听觉阈值较氯胺酮麻醉的显著提高（Ruebhausenet al.，2012）；采用乌拉坦麻醉豚鼠Cavia porcellus，听觉阈值和振幅不受影响，但可能通过阻滞突触传导而引起听神经动作电位和中枢传导时间延长，导致听觉反应时间延长（丁大连，张志坚，1995）。Bobbin 等（1979）的研究结果表明，戊巴比妥钠不会影响大鼠的听觉反应时间和振幅强度。Wang 等（2019）和Wang 等（2021）发现，戊巴比妥钠是用于开展龟类听力研究的理想麻醉剂。本研究发现，采用水合氯醛和戊巴比妥钠麻醉的红耳龟的听觉阈值和反应时间均无显著差异，因此水合氯醛也可用于开展红耳龟听力的研究。

本研究首次评估了5%水合氯醛和0.5%戊巴比妥钠对红耳龟麻醉效果及听力的影响。2 种麻醉剂对龟类均具有较好的麻醉效果，且戊巴比妥钠具有更短的麻醉起效时间，而水合氯醛能够维持更长时间的麻醉状态。因此可根据具体实验过程中的时效性，合理选取麻醉剂。此外，本研究结果表明水合氯醛和戊巴比妥钠均可用于开展红耳龟听力的研究。结合水合氯醛致死率低、来源可靠、性价比高等优点（蒋文臣等，2013；陈红燕等，2017；王丹等，2021），以及开展听力测定的时间要求，建议优先选用水合氯醛作为麻醉剂开展龟类听觉的研究。