高原鼠兔尿液的挥发性成分分析及引诱活性成分的筛选

乔卫杰，万俊，顾贵蓉，江涛，尕措，金洪，侯太平*

（1. 四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065；2. 四川省色达县草原工作站，四川色达626600）

化学通讯指动物产生的某些化学物质，在环境中传播，被其他个体接受，从而产生一系列的生理、行为活动的过程，对维持社会等级、个体与亲缘识别、繁殖育幼、领域维护与警惕天敌起着非常关键的作用（刘定震，田红，2010；Inagakiet al.，2014）。这些化学物质被称为信息素，尿液是信息素的重要来源（Zhanget al.，2019）。

哺乳动物尿液的化学成分复杂，可以编码多种信息，是化学通讯的重要载体。研究动物尿液不仅能解读动物间化学通讯密码——信息素，还能发现信息素对动物行为的影响。Takacs 等（2016）通过分析褐家鼠Rattus norvegicus的尿液、粪便等排泄物化学成分，鉴定获得39种化学成分，其中9种化学成分大量存在于雄性排泄物中；以其中6种化学成分（2-庚酮、4-庚酮、3-乙基-2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮、4-壬酮）作为引诱剂进行野外诱捕试验，捕获的雌性褐家鼠数量是对照组的10 倍。Silambarasan等（2019）测试了母猪的尿液、粪便、唾液和阴道分泌物，发现公猪面对发情母猪的尿液时，其嗅探尿液的时间更长，且分泌大量唾液，表明发情母猪的尿液中含有信息素。Rajanarayanan和Archunan（2011）在研究水牛Bubalus bubalis的4个不同发情阶段的尿液时，鉴定获得14种化学成分，并发现9-十八碳烯酸和4-甲基苯酚能够诱发雄性水牛的阴茎勃起等生殖行为。对圆虎鱼Neogobius melanostomus（Tierneyet al.，2013）、罗非鱼Oreochromis mossambicus（Keller-Costaet al.，2016）、狮子Panthera leo（Soso & Koziel，2017）、山羊Capra hircus（Sankarganeshet al.，2018）、家犬Ca⁃nis familiaris（Dzięciołet al.，2018）的研究发现，动物尿液中含有携带信息的特异性成分，能够将信息传递给同类，可以看出动物尿液中普遍含有信息素，能够影响动物行为和生理状态。

高原鼠兔Ochotona curzoniae隶属于兔形目Lagomorpha 鼠 兔 科 Ochotonidae 鼠兔属Ochotona，广泛分布于青藏高原及相邻地区（潘璇，米玛旺堆，2016；Zhanget al.，2020），是青藏高原的关键物种（Smith，2010；Wilson & Smith，2015）。高原鼠兔直接刈割取食植物，破坏土壤结构，加速草地退化，阻碍草地恢复（Weiet al.，2007；Chenet al.，2017）。近年来的研究发现，适量的高原鼠兔密度有助于碳、氮、磷等土壤养分的积累，提高植物的生物量（Pang & Guo，2017；Yuet al.，2017）。高原鼠兔的主要天敌有赤狐Vulpes vulpes、香鼬Mustela altaica、猎隼Falco cherrug等，研究表明环境中增加赤狐的尿液后，高原鼠兔的行为会受到影响，包括减少移动或短距离移动、降低取食活动（魏万红等，2004）。而多种天敌动物如香鼬、藏犬的粪便还会抑制高原鼠兔的取食、活动等，增加隐藏时间、探头频次，表明高原鼠兔能够通过化学通讯探测捕食风险（杨国荣，2015）。

刘定震和田红（2010）报道了许多啮齿目Rodentia 物种的尿液研究结果，但还没有高原鼠兔尿液的相关研究。本试验以高原鼠兔为研究对象，采用固相微萃取-气质色谱联用技术鉴定其尿液中挥发性化学成分，对比雌、雄性尿液中挥发性成分组成、含量的差异，分析筛选出高原鼠兔的潜在信息素。进一步通过旷场试验评价潜在信息素对高原鼠兔的行为影响，筛选出高引诱活性的成分，为进一步研究高原鼠兔信息素的通讯功能提供理论依据。

1 研究方法

1.1 高原鼠兔尿液挥发性成分鉴定

1.1.1 试验动物2019 年7 月，在四川省色达县天然草地使用捕鼠笼捕捉处于繁殖末期的高原鼠兔，然后筛选出成年健康个体12 只，雌雄各6 只。随后饲养在40 cm×40 cm×30 cm 的钢丝笼中，喂食垂穗披碱草Elymus nutans，早晚各喂100 g，同时适量喂水。试验流程按四川大学生命科学学院伦理委员会相关要求进行。

1.1.2 尿样采集室内饲养，适应48 h 后，开始收集尿液。当高原鼠兔产生新鲜尿液后，用一次性吸管吸取尿液到冻存管中，低温保存。持续收集24 h，避免昼夜间尿液成分波动，−20 ℃保存。

1.1.3 样品前处理检测前2 ℃自然解冻。在15 mL 顶空瓶中加入 1.5 g NaCl 和 5 mL 尿液，置于45 ℃水浴锅中溶解混匀，平衡5 min 备用。将100 µm PDMS 萃取纤维头（SUPELCO，美国）在气相色谱进样口（250 ℃）老化30 min，插入顶空瓶，推出萃取头水浴吸附20 min，收回。

1.1.4 固相微萃取-气质联用技术将萃取头插入气相色谱进样口（GCMS-QP2010 Plus，SHIMADZU，日本），250 ℃不分流解析3 min。进样口温度 250 ℃，起始温度 45 ℃，保持 5 min；以5 ℃·min−1升温至150 ℃，保持2 min；以10 ℃·min−1升温至280 ℃，保持3 min。载体为氦气，流速1.00 mL·min−1，不分流进样。质谱仪采用 EI 源，能量70 eV，离子源温度200 ℃，接口温度220 ℃，扫描范围30~500 m/z。

1.1.5 成分鉴定检测结果与NIST08 质谱库进行类似物比对检索，确定样品中的挥发性成分，并用峰面积归一化法分析各成分的相对含量，采用卡方检验检验尿液中成分是否具有性别差异。

1.2 旷场试验筛选引诱成分

1.2.1 试验地点与时间2020年7—9月，在四川省色达县牧场储藏室开展试验。

1.2.2 试验装置筛选引诱成分参考Takacs 等（2016）的方法设置圆形旷场（直径2 m，高度0.6 m，不锈钢材质），将圆形旷场均匀划分成4个扇形，布置监控摄像头、10 w日光灯、支架和遮光围布（图1）。

图1 圆形旷场试验Fig. 1 Circular open field

1.2.3 试验药品10 个潜在信息素药品包括2-甲基丁醛（98%）、2，5-二甲基吡嗪（98%）、2-庚酮（98%）、正己醇（99.5%）、喹啉（98%）、4-庚酮（98%）、壬醛（96%）、对甲酚（99.7%）、2-壬酮（99%）、苯乙醛（95%），溶剂为液体石蜡（99%），均统一购于上海麦克林生化科技有限公司。药品用液体石蜡配制为浓度500 mg·L−1、体积5 mL的试验溶液，备用。

1.2.4 试验方法将2 mL 试验溶液加入1 只5 mL 离心管中，用洁净棉花塞住管口后倒置。另一只离心管中加入2 mL 液体石蜡作为空白对照组。将上述2 只离心管分别放入2 个50 mL 烧杯中，然后分别放入2 个隔离罩内，并置于扇形区域中央，避免高原鼠兔直接接触离心管。将放入高原鼠兔的捕鼠笼置于旷场中5 min 后，让其自由活动10 min 后，取出高原鼠兔放回饲养笼。每次试验后，将药品区与对照区的试验溶液进行交换，并用酒精和清水擦拭旷场装置，掀开围布通风换气。每个药品分别用6 只雌性（编号：1~6）与6 只雄性（编号：11~16）重复试验，每只试验间隔24 h。

1.2.5 数据处理视频录像记录高原鼠兔在药品区与对照区的活动时间，采用独立样本t检验验证高原鼠兔对药品的偏好性差异，使用Excel 和SPSS 25 进行数据收集与处理，使用Origin 2021作图。

2 结果

2.1 挥发性成分分析

雌雄性高原鼠兔的典型色谱图（图2）显示，尿液的成分主要是烷烃类、醇类、烯烃类、酮类、醛类和吡嗪类等，共38 种（附表1），其中34 种在两性中都有检出。而壬醛、对甲酚仅在雌性中检出，2-壬酮、苯乙醛仅在雄性中检出。雄性尿液中共鉴定出36 种物质，个体间成分差异较大，仅有3 种在6 个尿样中同时检测到；雌性尿液中共鉴定出36 种，其中5 种在6 个尿样中同时检测到。

图2 雌性（A）和雄性（B）高原鼠兔尿液成分气相色谱图Fig. 2 Chromatogram of urine composition in female（A）and male（B）Ochotona curzoniae

2.2 挥发性成分相对丰度分析

雌性尿液中相对丰度最高的是2-甲基丁醛（22.46%±2.55%），与雄性的（6.64%±2.31%）差异极显著（P=0.030），同时正己醇、4-庚酮和喹啉的相对丰度也表现为雌性显著高于雄性。雄性尿液中相对丰度最高的是2，5-二甲基吡嗪（34.56%±2.63%），与雌性的（11.20%±5.45%）差异极显著（P=0.003），且2-庚酮的相对丰度表现为雄性显著高于雌性（表1）。其他26 种成分的相对丰度未见显著差异。因此，选择2-甲基丁醛、2，5-二甲基吡嗪、2-庚酮、正己醇、喹啉、4-庚酮、壬醛、对甲酚、2-壬酮、苯乙醛等10 个成分作为高原鼠兔的潜在信息素进行下一步试验。

表1 雌雄高原鼠兔尿液中差异成分的平均相对丰度比较Table 1 Comparison of average relative abundance of different components in the urines between male and female Ochotona curzoniae

2.3 潜在信息素的引诱活性

旷场试验结果表明，雌性在2，5-二甲基吡嗪药品区的活动时间为180 s±22.43 s，极显著高于其在对照区的活动时间（117 s±9.46 s，P=0.005）（图3：A）；雄性未表现出对10 种成分的偏好（图3：B）。

图3 10种潜在信息素对雌性（A）和雄性（B）高原鼠兔行为的影响Fig. 3 Effects of 10 potential pheromones on the behavior of female（A）and male（B）Ochotona curzoniae

3 讨论

固相微萃取-气质联用技术是一项成熟技术，被广泛应用于毒理学、医学等，能够有效鉴定唾液、血液、尿液等生物体液中挥发性成分（Curranet al.，2005）。目前已通过固相微萃取-气质联用技术对家猫Felis silvestris catus（Suzukiet al.，2019）、山羊（Sankarganeshet al.，2018）、狮子（Soso & Koziel，2017）等的尿液进行了鉴定分析。尿液是动物的代谢产物，受动物食性、年龄、性别、环境、代谢状态等多方面影响（刘定震等，2003），金钱豹Pan⁃thera pardus、狮子等肉食动物尿液中含有较多的含硫化合物（刘海彬等，2015；Soso & Koziel，2017）。本研究在高原鼠兔尿液中发现了烷烃类、醇类、烯烃类、酮类、醛类和吡嗪类等成分，且这些成分在不同性别、个体之间都存在种类、含量的差异。叶芳艳等（2018）提出，气味分子编码信息的方式有2 种：不同个体的差异成分和同种成分的不同含量。本研究认为，高原鼠兔尿液挥发性成分的种类、含量差异可能编码了个体的信息，有待进一步采集更多样本验证。

2-甲基丁醛、正己醇、4-庚酮、喹啉、2，5-二甲基吡嗪、2-庚酮、2-壬酮、苯乙醛、壬醛、对甲酚等10 种成分在雌雄高原鼠兔的尿液中存在显著差异，这10种成分在其他动物尿液也被广泛鉴定到，甚至被确定为信息素。摘除肾上腺会降低雌性小鼠Mus musculus尿液中 2-庚酮、2，5-二甲基吡嗪等6种成分的含量，同时受这6种成分的刺激，雌性小鼠会提前进入青春期（Novotnyet al.，1986）；加州鹿鼠Peromyscus californicus的尿液中含有2-庚酮、2，5-二甲基吡嗪（Jemioloet al.，1994）；雪貂Mustela furo的尿液中含有 2-庚酮、4-庚酮、2，5-二甲基吡嗪、壬醛等成分（Zhanget al.，2005）；2，5-二甲基吡嗪在花鼠Eutamias sibiricus的尿液中存在显著的性别差异，可能是花鼠的性信息素（王瑶等，2016）；狮子的尿液中含有2-壬酮、壬醛（Soso&Koziel，2017）。

高原鼠兔尿液中2，5-二甲基吡嗪的含量较高，且在不同性别中的含量差异显著。Zhang 等（2005）发现雄性雪貂尿液中的3 种主要成分（喹啉、2，5-二甲基吡嗪、4-庚酮）能够抑制雄性小鼠的嗅探行为。2，5-二甲基吡嗪能够延缓雌性小鼠发情时间，繁殖成功率降低34%，幼鼠死亡率升高（Jemiolo & Novotny，1993）。2，5-二甲基吡嗪显著提高了小鼠精子的变异频率，抑制了雄性的生殖功能（Daev，2003；Daev & Dukel'Skaia，2003）。2，5-二甲基吡嗪是刺激雄性小家鼠产生Lee-Boot效应的主要作用成分（Maet al.，1998）。综上，本研究中2，5-二甲基吡嗪对雌性高原鼠兔有显著的引诱效果，推测其可能是高原鼠兔的性信息素。在后续的研究中，可以分析高原鼠兔在发情期与非发情期、不同年龄阶段的尿液中2，5-二甲基吡嗪的差异，并结合高原鼠兔的行为观察、诱捕试验验证2，5-二甲基吡嗪的引诱活性。

附录Supplementary material

附表1 高原鼠兔雌雄尿液挥发性成分

Appendix 1 Volatile compounds in urines of female and maleOchotona curzoniae（http：//www.scdwzz.com/Articles/fujian20220108-1.pdf）