猪圆环病毒2 型和3 型混合感染与遗传进化分析

孙莹慧,夏 叶,陈鹏飞,缪德年

(上海市农业科学院,上海 201106)

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)是一种小型无包膜病毒,属于圆环病毒科圆环病毒属,为单链环状DNA 病毒。 PCV 基因组长度为1 700—2 000 bp,其中PCV1 基因组为1 759 bp,PCV2 基因组为1 767 bp 或1 768 bp,PCV3 基因组为2 000 bp。 PCV1、PCV2 和PCV3 均包含开放阅读框1(ORF1)和开放阅读框2(ORF2),其中ORF1 阅读框编码的Rep 蛋白与病毒复制密切相关,ORF2 编码的Cap 蛋白参与病毒吸附、入侵、脱壳及组装成新病毒粒子等全过程,同时Cap 蛋白作为病毒衣壳组分,是诱导机体产生免疫反应的主要保护性抗原。 当猪只被PCV 病毒感染时,血清中可检测出针对Rep 蛋白的抗体,而用PCV的灭活疫苗或亚单位疫苗免疫猪只后,不产生针对PCV Rep 蛋白的抗体[ 1]。 在临床应用时,Rep 蛋白主要作为鉴别PCV 感染的候选诊断抗原,Cap 蛋白是PCV 亚单位疫苗的候选抗原[ 2]。

2015 年以前,PCV1 和PCV2 已被报道,其中PCV2 可导致断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、仔猪先天震颤(CT)、呼吸道疾病综合征(PRDC)等[ 3]。 2016 年,在美国患有多系统疾病的猪群中首次发现PCV3,PCV3 也可导致生殖衰竭、猪皮炎和肾病综合征[ 4]。 2016 年底,我国在广东及广西的猪群中检出PCV3[ 5]。 对PCV2 和PCV3 基因组序列分析发现,PCV2 目前可分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e 等不同的基因亚型,其中PCV2b 和PCV2d 基因亚型的毒力明显高于PCV2a。 PCV3 基因亚型可分为PCV3a、PCV3b 和PCV3c。 PCV2 与PCV3 的基因组相比,两者开放阅读框的遗传距离较远,且PCV2 与PCV3 的抗原表位不具备同源性,故现有PCV2 商品化疫苗无法对感染PCV3的猪群提供交叉免疫保护[ 6]。 当前,我国猪群中PCV2 和PCV3 混合感染现象时有发生[ 7],为了解临床疑似猪圆环病毒患病猪的混合感染情况,本研究对疑似PCV 感染的样品进行流行情况调查及其遗传进化分析,以期为猪圆环病毒病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品及主要试剂

2020—2021 年从江苏省南通、江阴及山东省济宁等地规模化养猪场中采集疑似感染PCV 的猪肺脏、淋巴结等样品,共获得10 份样品,其中育肥猪5 份、哺乳仔猪3 份、保育猪1 份、流产死胎1 份。

猪圆环病毒PCR 检测试剂盒、猪圆环病毒3 型PCR 检测试剂盒购自哈尔滨元亨生物药业有限公司;DL-5000 DNA Marker、PrimeSTAR®HS(Premix)购自TaKaRa 公司;病毒基因组DNA 提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、pLB 零背景快速克隆试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司;DH5α化学感受态细胞购自诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 PCV 检测

取适量的组织样品置于离心管中,加入适量MEM,研磨成匀浆,反复冻融3 次,10 000 r∕min 离心10 min,收集上清液经0.22 μm 滤膜过滤后分装。 按照病毒基因组DNA 提取试剂盒说明书步骤提取病毒DNA。 根据PCR 检测试剂盒说明书对10 份病料依次进行PCV1、PCV2 和PCV3 检测,预期目的条带大小依次为652 bp、1 154 bp 和329 bp。 PCR 扩增程序为94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,62 ℃退火45 s 或55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35 个循环;72 ℃延伸10 min。 反应结束后,取5 μL PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.3 PCV2 和PCV3 全基因组序列扩增与测序

参照GenBank 登录的PCV2 和PCV3 全基因组序列,设计PCV2 和PCV3 全基因组扩增引物,PCV2 为(F: 5′-ATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTT-3′∕R: 5′-GTGGATTGTTCTGTAGCATTCTTCCA-3′), PCV3 为(F:5′-GCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3′∕R:5′-AAATTTCTGACAAACGTTACA-3′)。 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 PCR 反应体系为模板4 μL,上下游引物各2 μL(10 μm∕μL),Premix 25 μL,补水至50 μL。 PCR 程序为98 ℃2 min;98 ℃10 s,60 ℃退火5 s,72 ℃退火2 min,30 个循环;72 ℃退火5 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察。 采用胶回收试剂盒回收PCR 产物,将其连接至pLB 载体后转化至DH5α 感受态细胞,再接种至含氨苄青霉素抗性的LB 培养基,37 ℃培养12 h。 挑取单菌落培养后,取鉴定为阳性的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4 PCV2 和PCV3 全基因组序列分析

通过Megalign 软件中Clustal W 方法将分离株的全基因组序列与GenBank 登录的部分PCV2 和PCV3全长序列进行同源性分析,并利用MEGA 软件构建系统进化树。 利用MegAlign 软件对PCV2 Cap 蛋白氨基酸序列进行比对分析。 利用Jameson-wolf 方法对分离株Cap 蛋白抗原指数进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 PCV 检测

由图1 可知,PCV1 扩增片段约652 bp,10 份病料均为阴性;PCV2 扩增片段约1 154 bp,检出率为90%;PCV3 扩增条带为329 bp,检出率为30%;PCV2 和PCV3 混合感染率为30%,感染个体为哺乳仔猪和流产死胎。 综上,2020—2021 年引起江苏及山东部分地区猪场发生疑似猪圆环病毒病的病原主要是PCV2,其次是PCV3,且存在一定比例的PCV2 与PCV3 混合感染情况。

图1 PCV1、PCV2、PCV3 电泳检测Fig.1 Detection of PCV1,PCV2 and PCV3 in diseased samples by agarose gel electrophoresis

2.2 PCV2 和PCV3 全基因组序列扩增与测序

利用全基因组扩增引物对阳性样品进行PCR 扩增,将胶回收产物克隆至pLB 载体并测序分析,结果显示,毒株中有6 株PCV2 全基因组长度为1 767 bp,3 株PCV2 基因组全长为1 768 bp,3 株PCV3 全长为2 000 bp(表1)。

表1 毒株序列信息Table 1 Information of PCV2 and PCV3 isolated strains

2.3 PCV2 和PCV3 毒株的全基因组序列分析

2.3.1 PCV2 毒株的全基因组的同源性与进化树分析

参照GenBank 登录的20 株国内外PCV2 全基因组序列,对获得的9 株PCV2 毒株序列进行同源性分析并构建遗传进化树。 结果显示,这9 株PCV2 毒株之间的全核苷酸序列同源性为94.5%—100.0%,毒株间同源性最高的是2020 年采集的江苏毒株(20JS-7)与2021 年采集的山东毒株(21sd-2),为100.0%,表明两者为同一毒株。 9 株PCV2 毒株与国内外20 株参考株的同源性为93.4%—99.8%。 进化树结果显示,9 株PCV2 毒株基因型分别为PCV2d(5 株)、PCV2b(2 株)、PCV2a(1 株)和PCV2e(1 株)。20JS-10、21JS-3、21JS-10、20JS-7、21sd-2 均属于PCV2d 型,且主要与国内山东株(MF326373.1)、江苏株(JX982222.1)、湖南株(MH718995.1)的亲缘关系较近。 21JS-8 与20JS-6 同属于PCV2b 型。 21JS-9 为PCV2a 型,与湖北毒株(FJ870968.1)和上海毒株(KF850466.1)遗传关系近。 21JS-6 属于PCV2e 型(图2)。 综上,9 株PCV2 毒株之间有较高的核苷酸序列同源性,PCV2 毒株的优势基因型为PCV2d 型,其次是PCV2b 型,并伴有PCV2a 和PCV2e 型低频发生。

图2 PCV2 毒株的全基因组序列进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the full genomes of the PCV2 isolated strains

2.3.2 PCV3 毒株的生物信息学分析

对3 株PCV3 毒株进行全基因组序列同源性分析及遗传进化树绘制。 结果显示,3 株PCV3 毒株全长序列之间的核苷酸同源性为99.2%—99.8%,与18 株参考株间同源性为98.6%—100%。 序列进化树结果显示,3 株PCV3 毒株基因型为PCV3a(2 株)与PCV3b(1 株),其中21V3-8 毒株与中国湖南毒株(MW883 348.1)属于同一分支,21V3-7 毒株与中国广东毒株(MH491028.1)处于同一分支,21V3-10 与国外毒株(MW167067.1)亲缘关系较近(图3)。 综上,分离出的PCV3 毒株的全基因序列相似性较高,遗传距离较近。

图3 PCV3 毒株全基因组序列进化树分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the PCV3 strains

2.4 PCV2 和PCV3 毒株的Cap 蛋白氨基酸序列比对

Cap 蛋白氨基酸序列分析结果显示,9 株PCV2 毒株与3 株PCV3 毒株的亲缘性较远,氨基酸同源性仅为43.9%—45.1%。 本研究鉴定的9 株PCV2 毒株ORF2 编码的Cap 蛋白氨基酸位点存在多处突变,主要集中在aa53、aa68、aa134、aa190—aa210 区域。 优势基因型PCV2d 毒株Cap 蛋白在aa50—aa70、aa150—aa170 区域,抗原指数均明显高于3 个疫苗株。 其余PCV2a、PCV2b 和PCV2e 型的部分氨基酸位点也存在抗原指数升高现象(图4)。 与PCV3 参考株序列相比,本研究鉴定的3 株PCV3 毒株除24 与97位氨基酸发生突变外,其余氨基酸位点未发现变异,其Cap 蛋白抗原指数也与参考毒株差异较小。 综上,江苏及山东部分地区PCV2 毒株的Cap 蛋白氨基酸序列变异程度大且抗原指数较高,而PCV3 毒株的Cap蛋白氨基酸序列相对保守。

图4 PCV2 毒株Cap 蛋白抗原指数Fig.4 Cap protein antigenic index of PCV2 isolated strains

3 讨论

PCV2 和PCV3 混合感染母猪后可引起卵巢病理损伤,造成患病母猪卵泡细胞数量减少,卵母细胞细胞核皱缩,卵泡腔塌陷扁平,导致其无法正常排卵,最终引起母猪屡配不孕的现象,对我国养殖业的危害较大[ 8]。 姜子昕[ 9]调查发现,2019—2020 年山东省内各地屠宰场、养殖场和无害化处理厂中猪组织样品中PCV2 和PCV3 混合感染率为0.43%(8∕186 5)。 牟泓晔等[ 10]2022 年对浙江省181 份猪肌肉及全血样品进行PCV 检测,发现PCV2 和PCV3 混合感染阳性检出率为11.6%(21∕181)。 与上述学者的研究结果一致,本研究中也存在PCV2 和PCV3 混合感染,混合感染阳性率为30%,病料样品来自哺乳仔猪和流产死胎,这是否提示PCV2 和PCV3 可通过母猪先天性胎盘垂直感染,或者仔猪后天性被病毒感染,还有待进一步研究。

PCV2 基因型具有多样性,Xu 等[ 11]研究2018—2020 年我国PCV2 基因型流行病学结果表明,PCV2d型阳性率为47%,PCV2b 阳性率为29%,PCV2d 和PCV2b 为优势基因型。 本研究所获得的9 株PCV2 毒株也是以PCV2d 亚型流行为主,PCV2b 亚型次之,提示江苏及山东部分地区规模化猪场需重点关注PCV2b 和PCV2d 型的圆环病毒病防控。 本研究获得的PCV3 毒株全基因组序列与国内外部分参考株的同源性达98.6%—100%,Jia 等[ 12]研究表明,河南PCV3 分离株的核苷酸序列较参考菌株也表现出大于98%的高度同源性,本研究结果与之类似。 PCV2 Cap 蛋白氨基酸序列存在Y8thF、86SNPRSV91、190T191G206I等多处位点突变,而PCV3 毒株只有A24V、R27K 和E128D 等个别位点表现出差异[ 13-15]。 本试验获得的PCV3 毒株的氨基酸变异程度较小,保守性较高,而PCV2 毒株Cap 蛋白氨基酸位点呈现多处的散在性突变,其抗原指数与当前PCV2 疫苗株Cap 蛋白相比差异较大,其中部分PCV2 毒株共存在6 处抗原指数明显高于疫苗株,提示当前临床上PCV2 疫苗可能免疫效果不理想。 另外,PCV3 毒株与PCV2 毒株的Cap蛋白氨基酸同源性仅为43.9%—45.1%,提示需研制针对PCV3 毒株的疫苗。

本研究结果表明,临床上PCV2 感染猪中有部分个体存在与PCV3 混合感染的现象,而PCV2 与PCV3混合感染是如何引发机体致病及其对生猪养殖生产的影响有待进一步研究。