上海地区四种草莓病毒的检测分析

刘 雅,杨 静,张丽勍,李 斌,周艳孔,周 洁,高清华∗,段 可

(1上海市农业科学院林木果树研究所,上海201403;2上海海洋大学食品学院,上海201306;3上海市金山区农业技术推广中心,上海201500;4上海市浦东新区农业技术推广中心,上海201201;5上海市奉贤区农业技术推广中心,上海201400)

草莓果实色泽艳丽、柔软多汁、口感鲜美、芳香宜人,市场供应持续时间长,种植效益高,已成为我国乃至世界各地广泛栽培的重要特色园艺作物。截至2018年,我国草莓栽培面积达17.33万hm2,总产量达500万t,其中冷凉地区四季种植草莓面积达5 000 hm2,共选育品种112个[1]。草莓在上海地区进行规模化种植已经有30年以上,草莓果实应季上市时节适逢我国几个大的传统节日,深受广大市民喜爱,经济、生态效益俱佳,在上海郊区尤其是青浦、崇明、浦东、奉贤、金山、嘉定等区均有规模化种植。但目前上海郊区草莓生产中主栽品种是‘红颜’和‘章姬’,经过多年种植,出现抗病毒和抗病虫能力差、育苗难、品质下降等一系列问题,而其中草莓病毒病更是严重地影响了草莓产业的可持续健康发展。

世界上已报道的草莓病毒有25种以上,主要通过蚜虫、粉虱、线虫、卵菌等传播。其中,由蚜虫传播的草莓病毒病对草莓危害最为普遍[2-4],常见的有草莓轻型黄边病毒(SMYEV)、草莓斑驳病毒(SMoV)、草莓镶脉病毒(SVBV)和草莓皱缩病毒(SCV)等。草莓植株一旦感染病毒多是代代相传且具有潜隐性,只有多种病毒复合侵染时植株叶片才表现花叶、皱缩、褪绿黄化以及植株矮化等典型症状[5-6],造成生长结果能力下降;受单一病毒感染的草莓植株通常无症状,但产量和品质受到严重影响。据报道,与健康植株相比,‘Camarosa’草莓植株受SMYEV感染后无症状的植株,其单株总果实数、商品果实数和单果重均显著减少,下降达28%—63%;而且病毒复合感染植株的产量损失更大,与健康植株相比可减少78%—99%[7]。因此,在上海地区加快草莓脱毒种苗繁育及其应用推广是当前草莓产业持续健康发展的迫切需要。

目前,对于上海地区草莓病毒病的种类和发生为害产区分布情况缺乏长期性、系统性跟踪研究,本试验选取在我国南方地区为害严重的4种草莓病毒(SMoV、SMYEV、SVBV和SCV)作为检测对象,采用RTPCR分子检测技术测定这4种草莓病毒在上海郊区的发生情况,以期为草莓病毒病的有效防控提供指导,进一步为草莓脱毒种苗繁育及其应用推广提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

2019年3—8月于上海市金山区(46份)、奉贤区(37份)、浦东新区(65份)共采集到137份疑似病毒症状病样或病毒病典型症状材料,-70℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂与测定仪器

OMEGA植物RNA提取试剂盒(R6827-01)购自郑州威展生物科技有限公司;反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司;Taq DNA聚合酶购自上海博彩生物科技有限公司。

所用仪器包括ETC-811 PCR仪(东胜国际贸易有限公司)、Bio-Rad Powerpac电泳仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)和Tanon 3500凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.3 方法

根据相关文献设计引物[8-9],委托生工生物工程(上海)有限责任公司合成(表1)。

表1 4对草莓病毒特定引物序列Table 1 Specific primers sequences of four strawberry viruses

1.3.1 草莓总RNA提取和cDNA合成

按照RNA提取试剂盒说明书提取样品总RNA,利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性,使用Thermo Scientific Nanodrop2000微量紫外分光光度计进行纯度和含量测定。使用HiScript III 1 st Strand cDNA Synthesis Kit进行cDNA的合成,操作按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 病毒RT-PCR检测

以上述cDNA为模板,利用SVBV,SMoV、SMYEV和SCV 4种病毒引物进行RT-PCR检测,RT-PCR程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸45 s,30个循环;72℃延伸5 min。阳性对照为携带病毒特异片段的质粒(pUC19为载体骨架)DNA,阴性对照为纯水。取5μL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳,在凝胶成像系统中观察电泳结束后的DNA片段。PCR产物纯化后,连同特异引物送往上海生工生物工程有限责任公司测序,所得序列用DNAMAN软件与GenBank中对应病毒基因组序列进行多重序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 上海部分地区4种草莓病毒病的检测与分布

在上海市金山、奉贤和浦东3个地区均检测出含有SVBV和SMoV两种病毒,但未检测到SCV(图1)。其中,SVBV在金山区采集病样中检出率最高达到58.7%;SMoV在金山区和奉贤区采集病样中均有较高检出率,均在60%以上;但是,SMYEV病毒仅在浦东新区采集样品中检测到,检出率为1.5%。综合统计分析来看,病毒总检出率达到64.2%。在所检测4种草莓病毒中,以SMoV总检出率最高,达到43.8%。如表2所示,病毒总检出率较高的采集地是金山区和奉贤区,均在80%以上。4种病毒在各样品采集地区的分布规律性不明显,但不同地区采集样品的检出率差异明显(表2)。

图1 部分草莓样品中4种病毒感染情况的RT-PCR检测结果Fig.1 RT-PCR results of four viruses in some strawberry samples

表2 不同地区各病原病毒检出率Table 2 Detection rates of various pathogenic viruses in different regions

2.2 检测病毒阳性样品测序分析

利用4种病毒的特异性引物对上海市金山、奉贤、浦东的137份样品进行RT-PCR检测,SVBV、SMoV和SMYEV均扩增得到单一且清晰条带。其中SMYEV仅检出1个阳性样品,测序后与数据库(No.D12517)比对,相似度为100%。对SVBV和SMoV检出的多个阳性样品,随机抽取10个扩增产物符合预期大小的PCR产物纯化后测序,与数据库中对应病毒序列进行比较,样品测序结果均显示存在多个SNP(图2)。

图2 检出草莓阳性病毒序列比对分析Fig.2 Alignment analysis of strawberry positive virus detected

SVBV所选阳性样品中都存在11个位点的突变,所有样品在SVBV基因组序列(NC.001 725.1)2 426 bp和2 512 bp处发生了AT突变,在2 444 bp和2 494 bp处发生了CT突变,在2 446 bp、2 495 bp、2 497 bp、2 500 bp以及2 530 bp处分别发生了AG、TC、GT、GA以及TG突变;样品1-13在2 421—2 422 bp处由CC突变为TT,因此,SVBV病毒在上海地区至少存在2种不同的SVBV病毒小种(图2)。

SMoV所选阳性样品中,有4个样品(1-24、3-7、3-11和3-9)存在10个位点的突变,在SMoV基因组序列(AJ.311 875.1)6 285 bp、6 290 bp、6 293 bp、6 295 bp以及6 297 bp处分别发生了AT、TC、TA、CT以及GA突变;样品1-24、3-7和3-11在6 261—6 262 bp处发生了碱基置换(AT-TA),在6 304—6 305 bp处由TT突变为AC;样品3-9在6 262 bp和6 304 bp处均发生了TA突变,在6 305 bp处缺失了碱基T,因此,在上海地区至少有3种不同的SMoV病毒小种(图2)。

2.3 上海地区4种草莓病毒病的分子检测与表现症状综合分析

田间采集的137份样品中,除了带有疑似病毒典型症状如皱缩、斑驳、失绿等,还包括疑似病害感染症状如叶片萎蔫、褐变或根深红等。单一SVBV或SMoV感染材料多不具有典型病毒感染症状;SMov和SVBV复合感染率为21.2%,植株表现为生长势弱,叶片表现不一,如斑驳、皱缩、失绿、叶脉褪绿、大小叶等(图3)。

图3 部分样品病毒单一感染以及复合感染症状Fig.3 Symptoms of strawberry infected with single virus or multiple viruses

3 结论与讨论

本研究选取上海3个地区共137份样品中4种常见蚜虫传播病毒SVBV、SMoV、SMYEV以及SCV,采用RT-PCR分子检测技术测定其在上海郊区的发生情况,结果显示,感染SVBV和SMoV较为普遍,而SMYEV病毒仅在1份样品中检到,SCV未检测到,说明后两种病毒在上海地区比较少见或者不存在。

除单一病毒感染外,还有部分样品受到复合感染,主要为SMoV和SVBV复合感染,可使草莓出现皱缩、斑驳、失绿等明显症状。对比福建地区[10]和新疆地区[11]SMoV的检测结果(分别为19.3%和23.78%),SMoV在上海地区的检出率明显较高,达到43.8%。本研究采样中SVBV与SMoV的复合感染率也较高,达到21.2%,福建地区和新疆地区分别为12.9%和10.89%[10-11]。由此可见,这些常见病毒在我国普遍存在。另外,本研究采样地上海金山、奉贤、浦东所有采集样品中均未检测出SCV,推测SCV在各地发生率低,或者是病毒变异导致先前的检测引物不适用、待更新。

上海多数草莓种植户仍采用自繁自育的传统模式,多年连续栽培而从未采用脱毒种苗,导致草莓种苗质量下降。另外,草莓种植户多凭经验而很少按照草莓标准化栽培技术种植,不科学不规范的栽培管理措施加大了草莓感染病毒病的几率,严重影响了草莓的产量和品质,导致草莓畸形果增多,病虫害严重等[12]。因此,有效的草莓病毒病防控措施对草莓产业的发展有着重要的意义。目前,上海市大力推动草莓脱毒苗技术研发,先后在草莓主产区包括青浦、浦东、奉贤建立脱毒苗原种圃、生产苗育苗基地,向全市及周边地区提供优质种苗[13]。

田间杂草常常是草莓病毒的中间寄主,作为病毒传播媒介的昆虫通过田间杂草将病毒转移到草莓植株上,感染后进而造成其产量损失[14]。本研究中有35.8%的样品未检测出病毒感染,但却表现有叶片腐烂,枯死,萎蔫,叶片边缘焦黄,皱缩,叶片褐色等症状。可见,除了感染炭疽菌等病原菌外,还有可能是土壤肥力过大,发生肥害而导致叶片皱缩干枯,叶片发黄甚至枯死[15];另外,有些叶片边缘焦黄干枯的症状有可能是缺素导致的。因此,及时拔除病株、摘除病叶并进行销毁,增施有机肥料、合理施用化肥等对促进草莓健壮生长,提高抗病毒能力均有一定的效果[16]。

随着核酸测序技术和检测技术的发展,越来越多的草莓病毒被发现。最近报道了一种新型蚜虫传播草莓细胞质弹状病毒,暂命名为“草莓病毒1”(StrV-1),其感染症状为叶片不规则的褪绿以及花萼叶的增殖[17]。在栽培草莓中发现另一种新型病毒,暂命名为“草莓相关病毒1”(SaV1),并测定了其全基因组序列,SaV1N和L基因与9个已报道的细胞质弹状病毒的氨基酸序列同源性分别为32%—57%和38%—64%,归类为细胞质弹状病毒属[18]。近年来,草莓环状病毒3(SCrV-3),草莓环状病毒4(SCrV-4),草莓白化病毒(SPaV)等在我国也相继被报道[19-20]。另外,草莓病毒中还有一些少见的食源性病毒如诺如病毒,这类病毒很容易通过食物能进入人体中,对人体健康造成威胁,甚至在人群中造成流行性疾病[21-22]。因此,草莓病毒病的防治对草莓产业的发展以及人类健康都有着重要的意义。随着越来越多新病毒被发现,在栽培过程中病毒在植株体内不断积累,加之草莓病毒具有侵染途径多样、侵染方式复杂等特征,病毒防控工作也变得更加重要,新病毒一旦传播开来,会对生产造成巨大的损失。因此,今后需要进一步优化病毒检测方法、扩展检测对象,这对草莓病毒病的防控以及草莓产业的发展有着十分重要的意义。