高温胁迫对茄子花青素含量及其合成相关酶活性和基因表达的影响

张圣美,刘晓慧,尚 静,张爱冬,朱宗文,朱月林

(1 南京农业大学园艺学院,南京210095;2 上海市农业科学院设施园艺研究所,上海201403)

花青素是一种天然的水溶性色素,位于植物细胞的液泡中[1],是花和果实的着色物质[2],属于酚类化合物中的类黄酮次级代谢产物[3]。 花青素能通过调节相关酶的活性抑制癌变、预防心脑血管疾病及糖尿病的发生[4]。 除此之外,花青素还可以帮助植物抵抗各种生物和非生物胁迫[5],研究表明,花青素含量较高的转基因番茄植株耐热性较强[6]。 花青素的合成一般分为三步,首先是苯丙氨酸作为前体物质合成4-香豆酰CoA,这一阶段的关键酶是苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonialyase,PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、4-香豆酸辅酶A 连接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL);第二阶段是合成二氢黄酮醇类物质,此阶段是类黄酮物质合成的关键阶段,查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)是催化这一步的主要酶类;第三阶段是在二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)的催化下形成各种花青素。 此时, 花青素还处于不稳定的阶段, 需要通过类黄酮3-葡糖基转移酶(flavonoid 3-Oglucosyltransferase,3GT)糖基化反应使花青素形成稳定的结构,进而运输到液泡中贮存起来[7]。

茄子(Solanum melongenaL.)属于茄科茄属,直立分枝草本至亚灌木,果皮中含有丰富的抗氧化性较强的花青素,具有很高的食用价值[8-9]。 茄子开花结果期的适宜温度为25—30 ℃[10-11],超过35 ℃会对茄子的生长发育产生不利影响[12],造成其形态结构以及生理状态异常、品质降低、产量减少[13],同时,高温会通过削弱合成和增加分解的方式使植物中的花青素含量降低[14]。

目前关于高温胁迫对茄子表皮花青素合成相关酶的影响方面的研究较少,本研究通过研究高温对茄子果皮类黄酮和花青素浓度、花青素生物合成过程主要酶的活性以及相关酶基因的表达量的影响,探究高温胁迫对茄子果皮花青素产生的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试茄子(SolanummelongenaL.)品种为上海市农业科学院自主选育品种‘特旺达’。

1.2 试验处理

2018 年6 月25 日在上海市农业科学院庄行试验站播种,10 月30 日选择生长期相近、果实生长量相似的茄子植株18 株,将其随机分成3 组,每组6 株,移入人工气候室内进行27 ℃(CK)、38 ℃和45 ℃处理。 各处理的光照时间为12 h 光照∕12 h 黑暗、光照强度为500 μmol∕(m2·s)、相对湿度为70%。 分别在处理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、60 h 时削皮取样,取样时尽量少带果肉,测定花青素、类黄酮的浓度,以及PAL、 CHS、 CHI 、DFR、 ANS 、UFGT 的活性。 每个处理3 次生物学重复。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 茄子果皮花青素、类黄酮浓度以及相关酶活性的测定

采用酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(江苏酶免实业有限公司),参考吴翠平[15]的方法,略加改动进行测定。 将0.1 g 的茄子果皮用液氮研磨后加入0.9 mL 的0.05 mol∕L、pH 7.8 的磷酸缓冲溶液,1 000g、4 ℃离心20 min,取上清液。 酶标板上的微孔包被着待测酶的抗体,将样品作为抗原添加到微孔板中并加入样品稀释液和辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)结合物,37 ℃温育,洗涤液洗涤5 次。 用底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine,TMB)显色,温育15 min,加入1 mol∕L 的硫酸终止反应,450 nm 下测定吸光度(OD),绘制标准曲线,计算样品花青素与类黄酮的浓度以及各个酶的活性。

1.3.2 花青素合成相关酶基因的qRT-PCR

使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 提取RNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性,使用微量核酸蛋白分析仪进行浓度和纯度的测定。 使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录,使用TB Green® Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行实时荧光定量,以上试剂均购自日本TAKARA 公司。

根据转录组测序结果[16]进行待测基因的选择,目标基因特异性引物见表1,以茄子PGK为内参基因[17],由北京擎科生物科技有限公司进行引物合成,使用Applied Biosystems Quantstudio 5(ABI,USA)进行检测,设置3 次重复,使用2-ΔΔCt的方法[18]进行结果分析。

表1 基因的特异性引物序列Table 1 Gene-specific primer sequences

1.4 数据处理

使用Origin 8.0 软件绘图,SPSS 19.0 统计软件进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对茄子果皮花青素和类黄酮含量的影响

图1A 显示,随处理时间的延长,高温胁迫下,花青素的含量呈不断降低趋势,与对照相比差异显著,且45 ℃处理比38 ℃处理下降的幅度大。 38 ℃和45 ℃处理6 h 时,茄子果皮中花青素含量分别比处理0 h时低64.37%和69.99%,比CK 低65.72%和72.32%。

由图1B 可知,随着时间的延长,38 ℃和45 ℃处理下类黄酮含量呈现出持续下降的趋势,且与CK 间差异显著。 当胁迫60 h 时,38 ℃处理类黄酮含量较对照下降了27.47%,45 ℃较对照下降了39.71%。当处理48 h 和60 h 时,CK、38 ℃、45 ℃处理间的类黄酮含量呈显著差异,说明高温胁迫时间的延长会导致类黄酮含量下降。

2.2 高温胁迫对茄子果皮PAL 活性的影响

由图2 可知,随着时间的延长,38 ℃条件下,PAL 活性呈先平缓后升高而后再下降的趋势,24 h 时达到最大值,比CK 高16.93%。 在45 ℃条件下,PAL 活性呈现出先升高后降低的趋势,处理12 h 时达到最大值,较CK 高20.52%,比38 ℃条件下高8.91%。

2.3 高温胁迫对茄子果皮CHS 和CHI 活性的影响

由图3A 可知,随着时间的延长,38 ℃和45 ℃高温胁迫下CHS 活性呈下降的趋势,在处理60 h 时最低,与CK 相比分别下降39.34%和51.34%。

查尔酮异构酶(CHI)的活性变化与CHS 活性变化相似,38 ℃高温胁迫60 h 时较对照降低54.96%。45 ℃胁迫下,除处理0 h 和1 h 外,其余的处理时间下茄子果皮中CHI 活性均与CK 和38 ℃时有显著差异(图3B)。

2.4 高温胁迫对茄子果皮中DFR、ANS、UFGT 酶活性的影响

如图4A 所示,随时间延长,在38 ℃高温下,二氢黄酮醇还原酶(DFR)活性呈明显下降趋势,处理48 h和60 h 时分别较对照下降36.61%和47.24%。 45 ℃条件下,茄子果皮DFR 活性与CK 和38 ℃时相比显著降低,随着高温处理时间的延长,DFR 活性也在不断的降低,60 h 时达到最低值,比对照低73.24%。

图4B 显示,随时间延长,高温处理后的花青素合成酶(ANS)活性呈下降趋势,45 ℃比38 ℃条件下下降的多。 除0 h 外,其余处理间差异显著。 在处理60 h 时,38 ℃时较CK 减少了54.61%,较处理0 h减少了55.80%;45 ℃处理与CK 相比减少了71.15%,与0 h 相比减少了71.74%。

由图4C 可知,随时间的延长,高温胁迫下UFGT 活性呈现出明显下降趋势,其中45 ℃较38 ℃条件下下降的多,且差异显著,处理60 h 时,38 ℃条件下较处理0 h 下降了76.04%,较CK 下降了74.51%;45 ℃条件下,比未处理时下降了90.79%,比CK 下降了90.22%。

2.5 高温胁迫对茄子果皮中花青素合成相关酶基因相对表达量的影响

由图5 可知,处理3 h 时,SmPAL基因的表达量随着温度的升高逐渐升高;处理6 h 时,38 ℃和45 ℃下SmPAL基因的表达量均小于对照,且38 ℃时表达量更低。 在处理3 h 时,38 ℃条件下Sm4CL基因的表达量较对照高,45 ℃条件下与对照相比显著上升;处理6 h 时,38 ℃与45 ℃时该基因的表达量均较对照显著下降。SmCHI基因的表达量在处理3 h 和6 h 时显示出相同的规律,在38 ℃时显著升高,而在温度达到45 ℃时其表达量降低到与对照相当的水平。 相同处理时间下,温度越高,SmF3H、SmANS、SmUFGT基因的表达量越低。

3 结论与讨论

杜丹妮等[19]研究表明,低温会诱导花青素合成过程中结构基因的表达,从而使花青素的含量上升。而在高温环境时,花青素的合成会受到抑制,罗兰[20]研究发现,花青素在细胞质中是不稳定的,会与糖苷键结合形成花青苷运送到液泡中贮存,而高温会使呼吸速率加快,当植物体的碳水化合物储备不足时,花青苷的糖苷键会发生水解以补充植物体所需能量,进而抑制花青素的合成;YAMANE 等[21]发现,高温会抑制花青素合成的相关酶的活性,使花青素的合成减少,降解增多,从而使其含量显著降低。 本研究结果表明,随着高温胁迫时间的延长,花青素的含量不断下降,且与CK 之间存在显著差异,其中45 ℃比38 ℃条件下下降多,表明较高的胁迫温度与较长的胁迫时间,会加剧茄子果皮花青素含量的减少。

类黄酮是一类植物次生代谢物质,花青素属于类黄酮物质中的一种,一些关键酶的活性以及基因的表达量会直接影响到黄酮类化合物的合成和积累。 研究表明,适度低温会促进黄酮类化合物的累积[22],而高温会导致黄酮的含量减少[23],与本研究结果一致。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙烷代谢途径的重要调控位点,是合成花青素的限速酶,常作为衡量植物抗逆性强弱的指标[24]。 吴雪霞等[25]研究表明,在高温胁迫下,PAL 的活性呈现出先上升后下降的趋势。 Pan 等[26]研究表明,为减少热胁迫对植物造成的伤害,PAL 的活性会增加,进而使游离态SA 增加。陈雷等[27]研究表明,在植物受到温度胁迫时,其PAL 活性会显著上升,随着胁迫时间的延长,其活性逐渐下降。 本试验中,在38 ℃及45 ℃高温胁迫下,随着时间的延长,PAL 的活性呈先上升后下降的趋势,这与前人的研究结果一致,推测PAL 作用于花青素生物合成比较上游的位置,类黄酮的生物合成还存在其他分支路径,PAL 活性与花青素的含量之间不存在显著的相关性。

在花青素生物合成途径第二阶段中,CHS 和CHI 具有非常关键的作用,CHS 催化形成的查尔酮为类黄酮代谢提供碳架结构,研究表明,CHS基因过表达的拟南芥植株叶片会形成更多的花青素[28]。 CHI 可以将黄色查尔酮从容易离子化的双环状态转化为具有生物学活性的无色三环结构——黄烷酮[29]。 刘金花[30]发现,在黄芩种子萌发和生长过程中,CHS 活性会随着温度的升高不断下降,且在30 ℃左右时下降最多。 本试验结果表明,高温会抑制查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)活性,并且随着胁迫时间的延长,其活性会呈不断下降的趋势。

花青素生物合成的第三阶段涉及到三个比较关键的酶,DFR 可以催化二氢黄酮醇形成各种无色的花青素,ANS 将无色的花青素加氧转变为有色花青素,然后由UFGT 催化形成花青素苷[31]。 研究发现,紫心甘薯DFR 活性与花青素的合成密切相关,当DFR 活性较高时,花青素的含量也较高,反之,当DFR 的活性下降时,花青素的含量也会降低,其作为关键酶参与到了甘薯花色苷的代谢活动中[32]。 吴雪霞等[25]研究表明,高温会降低DFR、ANS、UFGT 活性。 李小兰等[33]发现温度是调控ANS 表达的重要环境因子之一,推测在高温下合成的花青素较低温少。 李智[34]研究证实高温使ANS基因的表达受到抑制,从而使花青素的合成量减少,Huh 等[35]研究表明ANS的表达水平受高温的影响比较大。 随着夜间温度的升高,与花青素合成相关基因的表达以及UFGT 的活性会受到抑制[36]。 本研究表明,在高温胁迫下,DFR、ANS 和UFGT 活性均随着胁迫温度的升高和胁迫时间的延长不断降低。

温度是对花青素合成相关基因表达量产生影响的一个重要的因素[37],高温会使关键酶基因的表达受到抑制[38],Liu 等[14]报道花青素的生物合成过程中相关的结构基因可以分为早期基因和晚期基因,CHS、CHI、F3H属于早期基因,而DFR、ANS、UFGT属于晚期基因,早期基因的表达与花青素的含量之间没有显著的相关性,而晚期基因是合成特定类黄酮所必需的,其基因的表达水平与花青素的含量呈正相关。 本研究表明,SmPAL和SmCHI基因的表达量与花青素的含量变化不一致,而Sm4CL、SmANS、SmUFGT则同花青素的含量变化趋势一致。 这可能是由于早期基因不仅要参与花青素的合成,同时也参与其他分支阶段,如木质素的合成所导致的。

综上,高温降低花青素合成途径中关键酶的活性以及一些关键酶基因的表达量,进而使得花青素与类黄酮的含量降低。