M gO纳米颗粒对油菜子叶外植体的影响

何晓兰,Marian Brestic,2*,郭书巧,倪万潮

（1江苏省农业科学院经济作物研究所，南京 210014；2斯洛伐克农业大学植物生理学院，尼特拉市 94976）

植物组织培养技术是染色体加倍、远缘杂交种的拯救、突变体筛选、转基因、种质资源离体保存、植物小孢子培养以及次生代谢积累等研究的重要试验手段［1-4］。高效的愈伤诱导、体胚再生以及不定芽和不定根的再生等是利用植物组织培养技术得以顺利完成这些试验的前提［5-6］。为了提高植物外植体再生能力，研究者们从基础培养基成分、外源激素水平和比例、促进植物分化的各类添加剂等方面对培养基组分进行了优化［7-8］。

MgO NPs是在药剂、水源污染修复、涂料及半导体等中得到广泛应用的环保纳米材料［8-15］。该纳米材料目前在生物学上的研究主要集中于菌类。在栅藻上亦有报道，100 mg/LMgO NPs处理栅藻可引起细胞的接触性物理损伤，完全抑制了其生长和叶绿素的合成［16］。在前期试验中，发现低浓度MgO NPs处理对油菜幼苗的生长未有明显影响，但高于2.0 mmol/L会显著抑制其生长（另文发表）。这些研究表明，高浓度的MgO NPs对生物的生长发育有明显的毒害效应。该纳米颗粒用于高等植物的研究，目前仅有一篇关于番茄的报道，MgO NPs处理番茄根部可诱导番茄根系产生活性氧，在其下胚轴和根中系统抗性相关基因GluA、水杨酸诱导基因PR1、茉莉酸诱导基因LoxA以及乙烯诱导基因Osm都得到上调，从而对细菌性枯萎病产生系统性抗性［17］。

油菜子叶外植体有较高的愈伤诱导和不定芽再生能力，对外源激素及AgNO3［18］等较为敏感，是较好的研究纳米颗粒效应的载体。本试验首次以油菜为研究对象，在其不定芽再生培养基（MS+4.5 mg/L 6-BA）的基础上添加不同浓度的MgO NPs，研究其对油菜再生效率的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘蓝型油菜品种‘宁油12’，由江苏省农业科学院经济作物研究所油菜研究室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌油菜种子苗的获得

挑选健康饱满的‘宁油12’种子，用70%的乙醇浸泡1 min，再用0.1%HgCl2灭菌15 min，然后在无菌条件下，用无菌水清洗3遍，播种于MS培养基［19］上，于25℃、光强600 mol/（m2·s）以及每天16 h光照下培养4—5 d。

1.2.2 子叶外植体不定芽再生培养

切取油菜带柄子叶外植体，转接于含0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L、6.0 mmol/L、8.0 mmol/L和 10.0 mmol/L MgO NPs［＜50 nm particle size（BET），Sigma-Aldrich，China］的油菜不定芽再生培养基（MS+4.5 mg/L 6-BA）上。每个处理3瓶，每瓶10个外植体。置于与生长无菌苗（对照）相同的环境下培养。

1.2.3 不定芽和不定根再生频率的统计

统计在添加不同浓度MgO NPs处理的培养基上的油菜子叶外植体每瓶长有不定芽和不定根的子叶外植体个数，以及每个子叶上再生出的超过2 mm长的不定芽个数，并称量子叶外植体质量。不定芽（不定根）再生频率=长芽（长根）子叶外植体个数/子叶外植体总数×100%每个子叶外植体平均不定芽数（个数）=不定芽总数/子叶外植体数

1.3 统计分析

用Excel 2003软件对数据进行统计分析，并作图。

2 结果与分析

2.1 M gO NPs对油菜子叶外植体不定芽再生频率的影响

由图1可见，在0—1.5 mmol/L内，随着培养基中MgO NPs浓度的提高，油菜子叶外植体不定芽再生频率逐步提高，在1.5 mmol/L时达最高值83.33%，较对照的36.67%有显著提高；超过1.5 mmol/L，再生频率急剧下降；达8.0 mmol/L时，油菜子叶外植体失去了不定芽再生能力。油菜单外植体再生不定芽个数亦在1.5 mmol/L时达最高值，明显高于对照（图2）。

图1 不同MgO NPs浓度对油菜子叶外植体不定芽再生频率的影响Fig.1 The effect of different concentration of M gO NPs on the rate of adventitious bud of cotyledon from Brassica napus L.

图2 不同MgO NPs浓度对油菜子叶外植体不定芽再生个数的影响Fig.2 The effect of different concentration of M gO NPs on the number of adventitious bud of cotyledon from Brassica napus L.

2.2 M gO NPs对油菜子叶外植体不定根再生频率的影响

由图3可见，培养基中添加1.0 mmol/L和1.5 mmol/L MgO NPs，油菜子叶外植体不定根再生频率均较对照有显著提高，在1.0 mmol/L下，频率达最高值63.33%。MgO NPs超过1.5 mmol/L，再生频率急剧下降，达10.0 mmol/L时，油菜子叶外植体失去了根的再生能力，但4.0 mmol/L处理的不定根再生率显著高于2.0 mmol/L处理的。

2.3 M gO NPs对油菜子叶外植体质量及形态的影响

由图4可见，在添加0—10.0 mmol/L MgO NPs的培养基中，培养基中MgO NPs为0.5 mmol/L和1.0 mmol/L时，与对照相比对子叶外植体的质量没有明显差距；当MgO NPs增至1.5 mmol/L时，较对照有了显著的提高；4.0 mmol/L处理时，外植体质量达到最高值4.84 g，显著高于对照的2.72 g；随着MgO NPs浓度的进一步提高，外植体质量逐步下降，但在MgO NPs为2.0 mmol/L时，再次出现与不定根再生力相应的变化，该处理的外植体质量低于更高浓度4.0 mmol/L的处理。

图3 不同MgO NPs浓度对油菜子叶外植体不定根再生频率的影响Fig.3 The effect of different concentration of M gO NPs on the rate of adventitious root of cotyledon from Brassica napus L.

图4 不同M gO NPs浓度对油菜子叶外植体质量的影响Fig.4 The effect of different concentration of M gO NPs on the weight of cotyledon from Brassica napus L.

如图5所示，随着MgO NPs浓度的提高，子叶外植体逐步膨大增厚，达4.0mmol/LMgO NPs时最为肥厚，超过此浓度，外植体逐步白化并失去活力。

图5 不同MgO纳米颗粒浓度对油菜子叶外植体形态的影响Fig.5 The effect of different concentration of MgO NPs on the form of adventitious bud of cotyledon from Brassica napus L.

3 结论与讨论

虽然MgO NPs在生物学上的研究已有一些报道［14-17］，但多集中于菌类，仅有一篇有关MgO NPs提高高等植物番茄抗病性的报道。本研究表明，培养基中MgO NPs达到1.5 mmol/L时可显著提高油菜子叶不定芽的再生频率和再生个数，且0.5—1.5 mmol/L时MgO NPs对外植体的不定根的再生也有明显提高，较对照有更高的活力。在本试验中，MgO NPs可能诱导了油菜外植体内源激素水平的提高，并改变了激素比例，这是否与水杨酸诱导基因PR1和茉莉酸诱导基因LoxA上调有关，有待进一步研究。

MgO NPs高于1.5 mmol/L时，对油菜再生能力有显著抑制，且超过6.0 mmol/L时，表现较强的抑制作用，油菜子叶外植体失去了不定芽再生能力，仅有较低的不定根再生能力。当MS培养基中Mg2+高于28 mmol/L时，对拟南芥镁会产生毒害效应，引起了一系列与ABA代谢有关基因的差异表达并促进了内源ABA的积累［20］。MgO NPs添加到培养基中，会有部分Mg2+释放，从而提高培养基中Mg2+浓度［16］，释放Mg2+的同时，会伴随着OH的大量产生导致脂类、蛋白类及核酸的破坏［21］。纳米颗粒尺寸减小时，其表面积会呈指数增长，更易与细胞产生物理或化学反应［22］。但在高浓度下，纳米颗粒可能会因团聚效应［23］降低纳米颗粒尺寸，从而降低对植物组织的伤害。在本试验中，2.0 mmol/L的 MgO NPs较4.0 mmol/L的对油菜子叶外植体再生能力的抑制更为明显，可能因团聚效应而缓解高浓度MgO NPs的毒害效应。

在植物组织培养和转基因研究中，提高愈伤诱导率和不定芽再生频率等是试验成功的关键［5-6］，目前一般运用 6-BA、ZT、IAA等外源激素［7］，以及 AgNO3［18］等添加剂来提高植物外植体的再生力，这些组分价格较高且一些成分还对环境有潜在的污染，MgO NPs为无毒、无味的白色粉末，可提高植物对土壤有害微生物的抗性［17］，降低大气中有毒物质［24-25］，以及水体污染净化和吸附［13］等。运用物美价廉，且环境友好的MgO NPs来提高植物组培效率，是个很好的选择。MgO NPs是否对其他种类的植物离体培养有较好的促进再生作用，有待进行下一步研究。

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