不同培养基质和培养时间对蛹虫草子实体生物量和蛋白质氨基酸组成的影响

于荣利,高新华,张红霞,唐庆九*

（1上海市农业科学院食用菌研究所，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，国家食用菌加工技术研发分中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海 201403；2上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海 201403）

目前，蛹虫草（Cordycepsmilitaris）已实现大规模人工栽培，因其具有极高的营养价值和保健功效，蛹虫草及其产品倍受消费者青睐［1］。张显科等［2］报道蛹虫草中氨基酸种类齐全，且含量高。氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，同时参与构成酶、激素和维生素，在调节生理机能、催化代谢过程中起着十分重要的作用。近年来，人们在对天然药物药理活性物质的探索中发现氨基酸与药效存在着密切关系［3-6］。

孟庆繁等［7］对人工培养的蛹虫草子实体及菌丝体中氨基酸含量与野生冬虫夏草（C．sinensis）进行了比较分析，发现野生冬虫夏草含有的各种氨基酸在人工培养的蛹虫草子实体中均存在。林群英等［8］比较了广东虫草（C．guangdongensis）、冬虫夏草和蛹虫草中的水解氨基酸含量，发现水解氨基酸的总量以冬虫夏草最高，蛹虫草次之，广东虫草最低。陆艳艳等［9］报道蛹虫草的固体培养残基、子实体、菌丝体中的氨基酸含量分别为8.32%、21.68%和23.19%。目前，未见关于蛹虫草不同培养基质和培养时间对其子实体氨基酸组成、含量影响的研究。本试验研究不同培养基质以及不同培养时间对蛹虫草栽培菌株CMH0810子实体生物量和氨基酸含量、组成的影响，以期为栽培获得优良蛹虫草子实体及其深层次开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基质

蛹虫草（C．militaris）菌株CM-H0810由上海市农业科学院生态环境保护研究所虫草课题组提供。

设置5个不同培养基质处理，培养基A：麦粒；培养基B：90%麦粒，10%蚕蛹粉；培养基C：米饭；培养基D：90%米饭，10%蚕蛹粉；培养基E：蚕蛹。

1.2 培养基质试验

菌株CM-H0810在PDA培养基上活化后，分别转接于装有5种供试培养基（20 g）的玻璃培养瓶（直径6.8 cm，高10.5 cm）中培养，菌丝培养、出草调控和采收参照文献［10］进行。每种培养基20瓶。

1.3 培养时间试验

每瓶装20 g麦粒，接种后20 d出草，分别于第35、40、45、50、55天和第60天收获子实体。每处理19瓶。

1.4 子实体生物量测定

样品60℃烘至恒重后称重，统计子实体生物量，粉碎备用。

1.5 氨基酸含量测定

氨基酸含量测定根据GB/T 5 009.124—2003［11］，略有改动。

1.5.1 样品制备

精确称取0.0001 g子实体粉样品于水解管中，加入6 mol/L盐酸15mL后，再加入新蒸馏的苯酚3—4滴，排尽管内的空气并充氮气，封口，于（110±1）℃恒温干燥箱内水解22 h后，取出冷却。将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50 mL容量瓶内用去离子水定容，吸取1 mL转移至5 mL容量瓶内，采用真空干燥器在40—50℃干燥，残留物用1—2 mL去离子水溶解后再干燥，反复进行2次，最后蒸干。用1 mL pH 2.2的缓冲液溶解，待测。

1.5.2 测定

准确吸取0.200 mL混合氨基酸标准溶液，用pH 2.2的缓冲液稀释到5 mL，作为测定用的氨基酸标准溶液，用氨基酸自动分析仪（型号L-8900，日本Hitachi公司）以外标法测定试样液的氨基酸含量。

样品氨基酸含量计算公式：X=｛［C×（1÷50）×F×V×M］÷（m×109）｝×100

式中，X：试样中氨基酸含量（mg/g）；C：试样测定液中氨基酸含量［nmol/（50μL）］；F：试样稀释倍数；V：水解后定容体积；M：氨基酸分子量；m：试样质量（g）。

1.5.3 营养价值评价指标及计算

营养价值评价指标包括氨基酸评分（Amino acid score，AAS）［12］、氨基酸比值系数（Ratio coefficient of amino acid，RC）［13］和化学评分（Chemical score，CS）［14］。其中，AAS为 1 g待测蛋白中该必需氨基酸占 1 g标准蛋白质中该必需氨基酸毫克数的比值。评分大于100，表明被测蛋白中该必需氨基酸的含量符合标准，蛋白质的价值高；反之，若评分小于100，则表明该必需氨基酸的含量低于标准［13］。RC的意义是与模式氨基酸相当量的一份食物氨基酸的比值。RC数值大于和小于1都表示偏离氨基酸模式，RC＞1表示该氨基酸相对过剩，RC＜1表示该氨基酸相对不足，RC最小的氨基酸则是限制氨基酸［15］。CS用来评价待测蛋白中某种必需氨基酸的相对含量与标准鸡蛋蛋白中该必需氨基酸相对含量的接近程度，CS值越接近100，则与标准鸡蛋蛋白的组成就越接近，该蛋白的营养价值也就越高［13］。计算公式分别如下：

式中：Ax为试样中某种必需氨基酸含量，mg/g；As为FAO/WHO标准模式某种必需氨基酸含量，mg/g；AASx为试样中某种必需氨基酸的氨基酸评分；AASe为标准鸡蛋蛋白中某种必需氨基酸的氨基酸评分；Ee为标准鸡蛋蛋白中必需氨基酸的总含量，mg/g；Ae为标准鸡蛋蛋白中某种氨基酸含量，mg/g；Ex为试样中必需氨基酸的总含量，mg/g。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对蛹虫草子实体生物量和蛋白质氨基酸组成的影响

在相同栽培条件下，蛹虫草子实体的生物量及氨基酸含量和组成比例均受培养基影响。生物量以培养基A（麦粒）最高，培养基B（麦粒+蚕蛹粉）其次，培养基E（蚕蛹）最低。用培养基C（大米）栽培的蛹虫草子实体氨基酸总量、必需氨基酸含量以及必需氨基酸含量与氨基酸总量比值（E/T）最低。以培养基E（蚕蛹）栽培蛹虫草，其子实体的氨基酸总量、必需氨基酸含量以及必需氨基酸含量与氨基酸总量比值高于其他培养基处理。大米或麦粒中添加蚕蛹粉后，栽培获得的子实体中氨基酸总量、必需氨基酸含量，以及必需氨基酸含量与氨基酸总量比值均较未添加有所提高。

表1 不同栽培基质对蛹虫草子实体生物量、蛋白质含量及氨基酸含量的影响Table 1 Effect of differentmedium on biomass，protein content and am ino acid content of C.m ilitias fruiting bodies

从表2可以看出，供试蛹虫草子实体蛋白中Thr、Val、Phe+Tys和Lys的评分均大于或接近于100。5种培养基质中，培养基D（大米+蚕蛹粉）栽培的子实体蛋白AAS较理想。供试蛹虫草子实体蛋白中Met+Cys和Thr过剩，Val、Ile和Phe+Tys不足，其中Leu为限制氨基酸。5种培养基质中，培养基A（麦粒）和D（大米+蚕蛹粉）栽培的子实体蛋白RC相对理想。供试蛹虫草子实体蛋白中各氨基酸的CS均比较低，其中培养基A（麦粒）和C（大米）栽培的相对高些。综合3个评价指标结果，认为培养基A（麦粒）和C（大米）栽培的蛹虫草子实体蛋白质的质量较高。

表2 不同培养基栽培的蛹虫草子实体中必需氨基酸的AAS、RC和CSTable 2 AAS，RC and CS of essential am ino acid in fruiting bodies of C.m ilitaris cultured by different com posts

2.2 培养时间对子实体氨基酸含量的影响

由表3可见，子实体在培养基A（麦粒）上生长的生物量随培养时间延长逐渐增加，于接种后第55天达到最高值，之后趋于平稳；氨基酸总量、必需氨基酸含量整体呈增加的趋势，第60天时，氨基酸总量、必需氨基酸含量均最高。各氨基酸含量变化趋势有所不同，其中Ser、Glu、Val、His含量随栽培时间延长均表现出降-升-降-升的趋势，Asp、Thr、Tyr、Orn和 Lys含量表现出先升后降再升趋势，而 Arg、Gly、Ile和 Leu含量均表现出先降后升的趋势。在6个供试培养时间中，样品必需氨基酸含量与氨基酸总量的比值均为0.31，说明虽然部分种类氨基酸相对含量有所变化，但必需氨基酸和非必需氨基酸相对含量基本不变。

进一步分析数据（表4）表明，培养时间对蛹虫草子实体蛋白中各考察氨基酸的AAS、RC和CS影响不明显，AAS值均以Phe+Tyr的最高，RC值均以Thr的最高，且第一限制氨基酸均是Met+Cys。

表4 不同培养时间的蛹虫草子实体中必需氨基酸的AAS、RC和CSTable 4 AAS，RC and CS of essential am ino acid in fruiting bodies of C.militaris cultured for different time

3 讨论

在实现人工栽培的几十种食用菌中，蛹虫草的人工栽培技术已比较成熟，经济效益比较高。关于蛹虫活性成分虫草素、腺苷以及多糖的研究较多［16-19］，但很少有人关注同一菌株在不同培养基质及不同培养时间条件下子实体成分含量的变化。本试验对不同栽培基质培养的蛹虫草子实体生物量及其氨基酸含量进行比较，发现不同培养基质不仅对蛹虫草子实体生物量有影响，对子实体中蛋白质质量也有明显影响；蚕蛹栽培的蛹虫草子实体生物量低，但氨基酸总量高；麦粒添加蚕蛹粉栽培蛹虫草不仅子实体生物量高，氨基酸总量也较高。本实验室还发现，蚕蛹栽培的蛹虫草子实体中多糖、虫草素含量显著高于其他栽培基质，麦粒+蚕蛹粉次之（另文报道）。综上所述，蚕蛹栽培的蛹虫草营养价值比较高；麦粒+蚕蛹粉栽培的蛹虫草不仅营养成分、活性物质含量较高，子实体生物量也较高，可以作为优质的保健品或药品的原料。

菌株CM-H0810接种后第55天时，子实体生物量最高，第60天时氨基酸总量最高，而栽培时间对子实体蛋白质质量影响不明显。本实验室还发现第45天时多糖含量最高。因此，培养时间可依据产品用途来决定。另外，不同菌株生长特性不同，建议在大规模生产之前，针对产品开发应用目标，进行适宜栽培基质和采收时间的优化试验。

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