脱落酸在低氮条件下延缓拟南芥叶片衰老

尹冬梅,梁 可,高马也,李 昊,倪迪安

（上海应用技术大学生态学院，上海 201418）

植物叶片衰老是叶片发育的最终阶段，不仅受到内部基因的表达调控，同时受到植物生长外部因素的影响。衰老引起的叶片同化功能的减退极大地限制了农作物产量的增加，对蔬菜等作物也会造成采摘后损失。因此，研究叶片衰老，不仅有助于认识发育过程，而且能够利用研究结果来建立调控叶片衰老的方法。

衰老是一个高度组织和管理完善的过程［1］。其中叶片衰老最重要的功能包括老叶氮的再转移。叶片衰老可以通过缺氮被加速，特别是当光合碳供给高的时候［2］。在无机氮同化合成含氮化合物中需要能源供应和碳骨架，所合成的氮化合物将用于产生贮存蛋白［3］。贮藏蛋白衰老过程中催化进一步产生了含氮化合物随后运输到活跃的生长区域。因此，含氮代谢和碳代谢在衰老过程中起到关键作用。此外，外部（氮可用性和光）和内部（调节代谢物和C/N比）因素及信号也显示了叶片对衰老感应［4］。低氮含量环境下生长的植物衰老的迹象出现较早，而且缺氮环境更是诱发及加速衰老的诱导因素［5］。

植物激素如脱落酸（ABA）调节叶片衰老过程［6］。在添加葡萄糖的低氮培养基上生长的ABA缺陷型突变体的衰老显著加速［7］。ABA被认为是促进叶片衰老的植物激素之一［8］。本研究在培养中添加不同糖源和氮含量，测定Fv/Fm值、叶绿素含量和衰老相关基因AtSAG12［9］的相对表达量，研究在低氮环境下外源ABA对拟南芥叶片衰老的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

试验采用拟南芥哥伦比亚生态型野生型（Col-0）和ABA敏感突变体（ahg3）［10］为材料，用质量分数0.1%的氯化汞表面消毒，接种于含有MS盐和琼脂的生长培养基上，于4℃黑暗条件下放置2 d，以获得种子萌发和生长的一致性，并在25℃、16 h光照、光照强度约2 500 lx条件下培养7 d后，转移到含有不同碳源、氮含量（表1）和ABA浓度的MS培养基上培养35 d。ABA（生工生物）通过0.22μm滤膜过滤灭菌后加入到含有不同的糖源和含氮量的高压灭菌MS培养基中。

表1 培养基成分Table 1 Composition ofmedia

1.2 方法

1.2.1 PSII原初光能转化效率(Fv/Fm)的测定

PSII原初光能转化效率（Fv/Fm）可反映植物叶片的衰老情况［11］，使用便携式调制叶绿素荧光仪PAM-2500（Walz，Effeltrich，Germany），取拟南芥叶片各5片，遮光情况下用叶片夹夹上，暗适应20 min，点击窗口的Fv/Fm按钮，2 s后读取Fv/Fm数值。

1.2.2 植物叶片叶绿素含量的测定

根据常用的方法稍作改良［12-14］，准确称取剪碎的新鲜样品0.5 g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2—3 mL质量分数为95%的乙醇，研磨成匀浆，再加乙醇10 mL，继续研磨至组织变白。静置3—5 min。全部过滤到25 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇定容。把叶绿体色素提取液3 mL左右倒入光径1 cm的比色杯内，以95%乙醇为空白对照，用752型分光光度计测定在663 nm和645 nm处的光密度值。根据Amon公式计算叶绿素含量。3次重复，计算每个处理的平均值。

式中：D663为在波长663 nm处的光密度值；D645为在波长645 nm处的光密度值；V为浸提液的最终体积（L）；W为叶片鲜重（g）。

1.2.3 AtSAG12的表达量测定

采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒（TaKaRa）提取RNA，RNA经过DNA酶消化后用PrimeScriptTMRT Master Mix试 剂 盒 （TaKaRa，RR036A）反转录得到cDNA，使用SYBR Green I嵌合荧光法进行实时定量PCR试验［15］，选用衰老相关基因AtSAG12为目标基因，以actin为内参，引物序列见表2。试验使用ABIStepOne Plus Real Time PCR仪进行反应。

表2 用于定量PCR的引物序列Table 2 Sequences of primers used for quantitative PCR

2 结果与分析

2.1 低氮条件下蔗糖促进拟南芥叶片衰老

叶片的衰老情况可以通过PSII原初光能转化效率（Fv/Fm）的测定来衡量［7］。Pourtau等［7］通过Fv/Fm的测定发现生长在添加葡萄糖的LN培养基上的拟南芥比在不添加任何碳源的LN培养基上生长的拟南芥衰老快得多。蔗糖是在大多数植物组织培养中常用的一种碳源。为进一步研究低氮环境对于拟南芥叶片衰老的影响，将野生型拟南芥（Col）和ABA敏感拟南芥突变体（ahg3）培养在不同含氮量（HN，LN）及碳源（111 mmol/L蔗糖或葡萄糖）的培养基中，经过35 d的生长后用叶绿素荧光仪检测不同培养基上生长的拟南芥叶片的Fv/Fm值。结果显示：生长在添加蔗糖的LN培养基上的Col和ahg3叶片比其他培养基中生长的叶片Fv/Fm低，且差异显著（图1），表明低氮条件下添加蔗糖可促进拟南芥叶片衰老。

图1 低氮培养基中添加蔗糖促进拟南芥叶片衰老Fig.1 Adding sucrose to low-nitrogen medium accelerated A.thaliana leaf senescence

2.2 外源ABA在添加蔗糖的低氮环境下延缓了拟南芥叶片的衰老

ABA的添加以及氮浓度的高低对于拟南芥叶片衰老有决定性的影响。利用拟南芥ABA缺失突变体（aba1-1）的研究表明，內源ABA的降低（ABA合成减少的功能缺失突变体）加快了在添加葡萄糖的LN培养基上生长的拟南芥的衰老过程［7］。添加外源ABA促进植物叶片衰老有很多报道，例如外源ABA促进水稻［8］和拟南芥［13］的衰老。因此，在低氮环境下研究外源ABA（20 mmol/L）对叶片衰老的影响非常有意义。本试验发现，在添加111 mmol/L蔗糖的低氮条件下，未添加ABA能够明显观察到黄化现象，添加外源ABA后黄化现象并不明显（图2）。初步说明了在添加蔗糖的低氮环境下，ABA延缓了拟南芥的衰老进程。

图2 外源ABA在添加蔗糖的低氮条件下延缓拟南芥叶片衰老Fig.2 Exogenous ABA delayed leaf senescence of ABA-sensitivemutant ahg3 cultured on low-nitrogen medium added with sucrose

为了进一步探索ABA在不同含氮含糖基础条件下对拟南芥叶片衰老的影响，试验中将野生型（Col）拟南芥分别种在含有不同质量浓度外源ABA（0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L）、含氮量（HN，LN）和碳源（111 mmol/L蔗糖或葡萄糖）培养基中，培养35 d后测定Fv/Fm值。结果显示：只有生长在含有蔗糖的低氮培养基中的Col植株叶片Fv/Fm值会随着外源ABA浓度的增加而增加，而生长在其他培养基中的植株没有观察到这种现象（图3-A）。

为了避免由于ABA的浓度过高对试验结果产生影响，将ABA敏感型拟南芥（ahg3）作为试验材料在添加较低质量浓度的ABA（0 mg/L、2 mg/L、5 mg/L）的上述培养基上生长，然后测定Fv/Fm值进行分析。得到了与野生型拟南芥（Col）相同的结果：只有生长在含有蔗糖的低氮培养基的ahg3植株叶片的Fv/Fm值会随着外源ABA浓度的增加而增加，而生长在其他培养基中的植株叶片的Fv/Fm值会随着外源ABA浓度的增加而降低（图3-B）。上述结果进一步表明：ABA能够延缓生长在有蔗糖的低氮培养基中的拟南芥植株叶片的衰老，而在其他供试条件下ABA促进拟南芥植株叶片的衰老。

图3 通过最大光合效率测定拟南芥衰老Fig.3 A.thaliana senescence was determ ined in terms ofmaximum photosynthetic efficiency（Fv/Fm）

叶片衰老也可以通过叶绿素含量的方法进行检测［13］。以野生型拟南芥（Col）为材料，在添加111 mmol/L蔗糖的不同氮含量（HN，LN）和不同质量浓度外源性ABA（0 mg/L、20 mg/L）的培养基上生长35 d后，测定叶绿素含量加以验证。结果表明，在添加蔗糖的LN培养基上生长的野生型拟南芥叶绿素含量随外源ABA的浓度增加而上升，相反，添加蔗糖的HN培养基上生长的野生型拟南芥叶绿素含量随外源ABA的浓度增加而下降（图4）。

为进一步验证上述结果，测定了在添加蔗糖的低氮培养基上生长的拟南芥ABA敏感突变体（ahg3）叶片的衰老相关基因AtSAG12的表达量［9］。结果表明：在添加5μmol/L ABA和111 mmol/L蔗糖的LN培养基上生长ahg3的AtSAG12的表达量比在不加ABA的培养基上生长的明显低（图5）。

图4 通过测定拟南芥叶绿素含量检测拟南芥衰老Fig.4 A.thaliana senescencewas determ ined in terms of chlorophyll content

3 结论与讨论

图5 添加ABA（0μmol/L，5μmol/L）和蔗糖的LN培养基上生长35 d的ahg3叶片的AtSAG12表达量Fig.5 AtSAG12 expression of ahg3 p lants grow ing for 35 d on low-nitrogen medium added with sucrose and 0 or 5μmol/L ABA

脱落酸是植物响应外界生物胁迫及非生物胁迫的重要调节因子，如种子成熟和休眠、器官脱落、干旱抗性以及叶片衰老等［16］。植物叶片衰老最主要的特征是叶片黄化、叶绿素降解［17］、PSII原初光能转化效率（Fv/Fm）下降［7］。本研究采用培养基中添加不同糖源和氮含量，测定Fv/Fm值、叶绿素含量和衰老相关基因AtSAG12［9］的相对表达量等方法，得到如下两个结论：（1）低氮条件下蔗糖促进拟南芥叶片衰老，（2）外源ABA可延缓添加蔗糖的低氮环境下拟南芥的衰老。

ABA延迟氮缺乏条件下的衰老进程可能是由于促进叶绿素合成和抑制叶绿素的降解，延缓衰老也可能由于较高的培养温度［18］。本试验中低氮浓度和较高的温度（25℃）所引起的ABA延迟衰老还有可能归因于ABA具有保护植物免受高温产生的活性氧（ROS）损伤的能力［18］。

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