程序降温处理过程中Nutlin-3对含水生菜种子抗冷性的影响

周 强,韩颖颖,沈梦琪,李维杰,刘宝林

（上海理工大学医疗器械与食品学院，生物系统热科学研究所，上海 200082）

非生物胁迫对植物的影响一直是植物研究的热点，常见的非生物胁迫包括干旱、盐碱、低温、辐射等。其中低温胁迫是植物生长过程中无法避免的影响因子，每年各种植物以及农作物因为这些因素产生的经济损失重大。据国家统计局数据显示，2014年低温冷冻和雪灾受灾面积达到0.21万hm2，绝收面积达到16.82万hm2。减少植物应对低温冷害而引起的经济损失已经是研究的热点。

研究表明植物自身在应对低温胁迫时会有应对机制，如调整代谢、调节基因表达等［1］。对于植物来说，低温的伤害不仅仅是对于植株，对于种子也会有影响。根据种子脱水行为等特点将种子分为正常型、中间型和顽拗型［2］。正常型种子含水量低，不易受到低温的伤害。而顽拗型种子因为含水量较高，低温下不容易保存。中间型种子可以脱水干燥，但是对低温保存敏感。本试验中用到的‘罗莎绿’生菜种子属于正常型种子，在经过吸水处理后进行程序降温处理。通过转录组测序技术对以不同降温速率程序降温后种子的差异基因表达进行检测，发现经过处理之后，泛素连接酶介导的蛋白降解功能有差异，许多泛素连接酶都参与其中［3］，说明泛素连接酶参与种子对程序降温速率的感应。

在动物细胞中，泛素抑制剂Nutlin-3可以有效与E3泛素连接酶MDM2结合，从而阻断MDM2-P53环路［4-6］。但是其在植物中是否也调节泛素连接酶功能还未有研究，本试验利用Nutlin-3对含水生菜种子进行处理，研究Nutlin-3对程序降温过程中种子的耐冻性和泛素连接酶E3的影响，从而找到Nutline-3在植物中的靶基因，同时为顽拗型种子的保护提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

‘罗莎绿’生菜（Lactuca sativa‘Rosa Green’）种子，购自凤鸣雅世种子公司（北京）。

1.2 吸胀试验

将生菜种子随机置于两种培养基中（表1），使其充分吸水，11 h后取出。因为Nutlin-3溶液的配制是在100 nmol/L有机溶剂DMSO里进行的，所以将等体积的DMSO处理设置为对照组。

表1 吸胀培养基组分Table 1 Components of imbibition medium

1.3 程序降温处理

将经吸水处理后的种子置于程序降温仪中，从初始温度21℃开始以60℃/h的降温速率进行程序降温至-20℃后取出，然后进行发芽率、基因表达、生理指标的检测和相关数据的显著性分析。

1.4 发芽率测量

将程序降温处理后取出的种子在室温下恢复30 min，分别取25粒播种于1%的琼脂糖培养基，并置于光照培养箱中进行萌发，每处理3次重复，统计种子萌发情况并进行显著性检验。光照培养箱的参数为23℃，光照16 h/d。

1.5 基因表达检测

将程序降温取出后的种子立即置于液氮中并进行总RNA提取（RNAiso，TaKaRa），然后通过去除基因组DNA反应和逆转录反应获得cDNA。根据Beacon designer设计相关基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。以ABI 9500进行实时定量荧光PCR。表2为荧光定量PCR的程序设置。

表2 荧光定量PCR程序设置Table 2 Settings of real-time PCR

1.6 脯氨酸含量的测定

将程序降温处理后的种子每份称取0.16 g，采用茚三酮法测定脯氨酸含量［7］。

1.7 超氧化物歧化酶活性的测定

将程序降温处理后的种子每份称取0.26 g，置于预冷的研钵中，加入预冷、pH 7.8的磷酸缓冲液10 mL，充分研磨。分别吸取1.5—2.0 mL浆液至离心管，于4℃、1 000 r/min离心20 min，取上清。采用氮蓝四唑（NBT）法测定 SOD活性［8］。

2 结果与分析

2.1 程序降温对含水生菜种子发芽率的影响

研究表明，种子的发芽率是可以体现出种子的萌发能力的［9］。由表3可见，Nutlin-3处理组与对照吸胀组在温度降至-5℃和-10℃时，发芽率无显著差异，说明在此温度范围内种子并没有受到伤害。在温度降至-15℃时，发芽率开始出现降低，但大部分种子仍然能够正常发芽。说明无论是程序降温处理还是抑制剂Nutlin-3处理都没有对种子造成明显伤害，也说明生菜种子对低温有一定的抗冷性。当温度降低至-20℃时，对照组发芽率出现明显下降，而Nutlin-3处理组几乎没有变化。由此可见，低温处理会对种子造成一定的伤害，当温度降低至-20℃时伤害程度最高。与对照吸胀组相比，Nutlin-3处理组虽然未能提高发芽率，但却没有出现明显的下降。说明Nutlin-3可调控种子内部某种生物学机制，从而保护种子胚，提高种子的抗冻性。

表3 抑制剂对生菜种子发芽率的影响Table 3 Effects ofinhibitors on the germ ination rate of seeds

2.2 泛素连接酶通路相关基因的实时荧光定量PCR检测

泛素化对于细胞内的很多蛋白以及生物学功能中都有着重要的作用，比如细胞表面的受体、转录因子、调控细胞凋亡等［10-12］。泛素化过程就是泛素分子在经过E1泛素激活酶、E2结合酶、E3连接酶的作用之后对底物蛋白进行特异性修饰的过程［13］。泛素化过程最重要的酶就是E3泛素连接酶，它可以对底物进行特异性识别并且修饰［14］。在真核生物当中根据与E2泛素结合酶结合区域同源性的分析，可以将E3连接酶大致分为两类：HECT型和RING型，其中RING型E3连接酶又可以分为Multiple-RING型和Single-RING型［15-16］。通过实时荧光定量PCR检测，鉴定Nutline-3对各类E3连接酶的影响，从而确定Nutline-3在植物细胞中的靶标，并且探索泛素化途径与植物抗冷性的关系，确定参与低温条件下泛素化修饰关键基因。

TRIP12作为HECT型E3连接酶的典型代表，对其进行荧光定量PCR（Real-time PCR）检测显示，对照吸胀组对TRIP12表达没有明显的影响。Nutline-3吸胀组在程序降温处理时提高了TRIP12的表达（图1A）。

图1 Nutlin-3对程序降温处理后TRIP12、COP1、SKP1、F-BOX的m RNA表达水平的影响Fig.1 The effects of Nutlin-3 on m RNA level of TRIP12，COP1，SKP1，F-BOX after programmed cooling

COP1属于Single-RING型E3连接酶，SKP1和F-BOX是多亚基RING型E3连接酶。对于COP1基因来说，对照吸胀组基因表达量经过程序降温处理之后明显降低。Nutlin-3吸胀组在未程序降温时显著抑制了COP1的表达。而程序降温后，Nutlin-3吸胀组提高了COP1的表达，说明低温下Nutlin-3的处理能够诱导COP1的表达（图1B）。

对于多亚基RING型E3连接酶SKP1来说，对照吸胀组经过程序降温处理无明显差异。Nutlin-3吸胀组在未程序降温条件下对SKP1基因表达无影响，在程序降温处理后对基因表达有显著促进作用（图1C）。而对于F-BOX基因，对照吸胀组经过程序降温抑制了F-BOX的表达。Nutlin-3吸胀组在未程序降温条件下抑制了F-BOX的表达，程序降温条件下促进了F-BOX的表达（图1D）。

对于与冷相关的E3连接酶HOS1来说，属于Single-RING型E3连接酶［17］。HOS1可以泛素化降解抗冷转录因子ICE1，调节ICE1的蛋白水平。检测结果表明，对照吸胀组中程序降温对于HOS1基因的表达没有影响，而Nutlin-3吸胀组在程序降温条件下显著降低HOS1的表达（图2A）。

ICE1是重要的抗冷因子，室温下处于非激活状态，而低温应激情况下被激活并且可以促进CBF的转录［18］。对照吸胀组ICE1表达无明显增加，而Nutlin-3吸胀组在程序降温条件下显著增强了ICE1的表达（图2B）。

图2 Nutlin-3对程序降温处理后HOS1和ICE1的mRNA表达水平的影响Fig.2 The effects of Nutlin-3 on m RNA level of HOS1 and ICE1 after programmed cooling

2.3 种子内脯氨酸含量的变化

脯氨酸作为一种渗透保护性物质，是氨基酸中水溶性最大的一种。当植物受到低温胁迫的影响时，会产生大量的脯氨酸来抵抗冷应激，以此提高植物的抗寒性，因此可以作为抗寒育种的生理指标［19］。本研究对不同浓度标准品测定和数据分析后，得到脯氨酸标准曲线为Y=0．1653X-0．2090。

可以看出，低温处理后对照组和处理组的脯氨酸含量都有所提高，与现有结论相符。但降温前后两组的脯氨酸含量差异不明显，说明Nutlin-3对提高程序降温中种子的抗冷性没有通过脯氨酸途径完成（图3A）。

2.4 种子内SOD酶活性的变化

植物在低温胁迫下产生的氧自由基会对核酸，蛋白质等生物大分子造成伤害［20］。而植物体内存在自由基氧去除相关的酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物歧化酶（POD）等［21］。其中SOD可以作为植物所受伤害程度的指标，也可以间接的反应耐寒性的强弱［21］。可以看出，对照组低温处理之后SOD酶活性出现上升，说明植物受到了伤害。Nutlin-3处理组低温处理后的种子内SOD酶活性与对照吸胀组相比出现明显降低，说明Nutlin-3处理组种子在-20℃下受到的伤害低于对照吸胀组，Nutlin-3处理增强了植物的抗冻性，这Nutlin-3组发芽率要高于对照组相一致（图3B）。

图3 Nutlin-3对程序降温处理后脯氨酸含量和SOD活性的影响Fig.3 The effects of Nutlin-3 on the content of Pro and the activity of SOD after programmed cooling

2.5 程序降温过程中Single-RING型E3泛素连接酶基因的表达水平变化

2.5.1 ICE1的表达变化

对照组在程序降温的过程中，ICE1的表达量先升后降，在-10℃时达到峰值，且普遍高于21℃时的表达量值，证明ICE1确实是一个冷响应因子。而在Nutlin-3处理组中，在-5℃至-15℃的温度范围内，Nutlin-3对ICE1作用不明显，在-20℃条件下，Nutlin-3显著促进了ICE1的表达。这与表型结果相一致，即Nutline-3在-20℃显著促进种子的抗冻性（图4A）。

2.5.2 HOS1的表达变化

对照组中，HOS1在-5℃至-15℃的温度范围内表达量增加；HOS1在-20℃条件下与未程序降温对照组相比无明显变化。Nutlin-3处理组在-5℃至-15℃的温度范围之内无明显变化，在-20℃条件下Nutlin-3显著抑制HOS1的表达（图4B）。Nutlin-3处理对ICE1和HOS1两者相反的作用趋势显示出HOS1和ICE1之间的关系，即HOS1是ICE1的上游抑制调控因子。

2.5.3 COP1的表达变化

对照组中，随着温度的降低，在-5℃至-15℃范围内COP1的表达有上升的趋势；COP1在-20℃条件下与未程序降温对照组无明显变化。Nutlin-3处理组中，-5℃至-15℃范围内COP1的表达无明显变化，但是-20℃条件下相比于对照组，Nutlin-3显著提高了COP1的表达（图4C）。

图4 Nutlin-3对程序降温处理后ICE1、HOS1、COP1的mRNA表达水平的影响Fig.4 The effects of Nutlin-3 on mRNA level of ICE1、HOS1、COP1 after programmed cooling

HOS1、ICE1、COP1在降温至-15℃前都有升高的趋势，说明三者与种子程序降温过程中耐冻性形成有关。-20℃条件下Nutline-3对ICE1和COP1表现出相同的调控趋势。COP1作为单环指泛素E3连接酶，与HOS1一样是否也调控ICE1的泛素化，是将来需要进一步研究的课题。

3 讨论

Nutlin-3作为动物细胞内E3连接酶MDM2的抑制剂，可以阻断MDM2与抑癌基因P53的连接，但是到目前为止还没有关于Nutlin-3应用于植物泛素化连接酶的研究。

生菜种子作为一种正常型种子，其不仅含水量低而且耐冻性好，是种子低温保存的模式生物。将其进行吸胀处理并经过程序降温之后可以用来研究其抗冻性，可为顽拗型种子的保存提供参考。

对种子的发芽率进行统计发现在程序降温至-10℃之前发芽率几乎没有变化，而在降温至-15℃时，发芽率开始出现下降趋势。当温度降低至-20℃时，对照组发芽率显著下降，说明此温度会对种子造成冷冻伤害。但是Nutlin-3处理的种子在此温度没有出现下降，推测Nutlin-3处理影响了细胞内泛素化调控从而增强了种子的抗冻性。

从结果可以看出，虽然Nutlin-3对不同的E3连接酶基因都有不同程度的影响，但是对于HOS1的影响更加明显。所以，可以推测在此降温速度下，Nutlin-3的靶基因可能为HOS1。同时从结果中可以看出，冷相关重要转录因子ICE1受到了Nutlin-3的促进。由此可以得出，Nutlin-3可能是通过影响了ICE1蛋白的泛素化调控过程，从而增强种子的抗冻性。但是Nutlin-3如何抑制HOS1基因的还需要进一步研究。另外COP1作为泛素连接酶基因与ICE1表现出相同的表达趋势，都受到Nutlin-3促进。COP1与ICE1之间的相互调控关系也有待进一步研究。

植物细胞和组织在低温条件下会受到低温损伤，SOD可以作为一个伤害指标［21］。Nutlin-3吸胀处理的生菜含水种子在程序降温过程中SOD的活性明显降低，表明种子受低温伤害较小，程序降温至-20℃时种子的发芽率高于对照吸胀处理也体现了这一点，说明Nutlin-3在一定程度上保护了程序降温对种子造成的伤害。但是这种作用是否是通过ICE1和HOS1两种因子来完成的还无法得出结论。

脯氨酸是植物体内广泛存在的有机溶剂，植物在干旱、低温和高盐等情况下游离的脯氨酸含量会增加用于保护机体免受伤害［22］。在本试验中，低温下脯氨酸含量的增加符合已有的研究结果，但是经过Nutlin-3处理之后相比于对照组几乎没有促进的作用，说明Nutlin-3对种子的保护不是通过增加脯氨酸合成实现的。

经过相关基因表达的检测和SOD、脯氨酸这些生理指标的测量后，可得出结论：Nutlin-3处理提高了种子的耐冻性，Nutlin-3可能通过抑制HOS1从而阻止抗冻蛋白ICE1的泛素化降解。

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