不同品种群牡丹表型SSR标记的遗传多样性及聚类分析

郭丽丽,李明月,郭大龙,马慧丽,张丽霞,侯小改*

（河南科技大学农学院/牡丹学院，洛阳 471023；河南科技大学林学院，洛阳 471023）

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是芍药科芍药属牡丹组落叶灌木，集药用价值、观赏价值和油用价值于一身。牡丹加工而成的丹皮是重要的中药材，牡丹种子具有抗癌、抗氧化、抑菌、消炎、止痛之功效［1-2］。牡丹籽油富含亚麻酸、亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸，同时富含药用牡丹有效成分，具有降血糖、降血脂、降胆固醇、增强免疫力等医疗保健功效［3］。

中国是世界牡丹的发祥地和世界牡丹王国，有着丰富的牡丹野生种质及品种资源［4］，现已形成由17个品种群构成的复杂体系，包括各色各花型牡丹栽培品种2 000多个［5］，分为革质花盘亚组和肉质花亚组。革质花盘亚组包括牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）、矮牡丹（Paeonia jishanensis T.Hong et W.Z.Zhao）、卵叶牡丹（Paeonia qiui Y.L.Pei et D.Y.Hong）、杨山牡丹（Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang）、紫斑牡丹（Paeonia rockii T.Hong et J.J.Liet D.Y.Hong）和四川牡丹（Paeonia decomposita Hand.-Mazz）；肉质花亚组包括紫牡丹（Paeonia delavayi Franch.）、狭叶牡丹（Paeonia potanini kom.）、黄牡丹（Paeonia lutea Delavay et Franch）和大花黄牡丹（Paeonia ludlowii Hong）［6］。在长期驯化栽培过程中，形成了数量众多的牡丹栽培品种，其杂交后代颜色丰富，花期较晚且长，丰富了牡丹的遗传变异。由于牡丹分类地位不断更新，新品种不断开发，遗传背景及品种间亲缘关系尚不清楚，造成对其种质资源遗传多样性的研究愈加困难［7］。

采用分子标记鉴定方法可提早预测杂交幼苗的表现性状，缩短育种年限，鉴定品种间的亲缘关系，分析牡丹种质资源的遗传多样性［8］。科研工作者利用RAPD（Random amplified polymorphic DNA）［9］、AFLP（Amplified fragment length polymorphism）［10］、SRAP（Sequence related amplified polymorphism）［11］、cpDNA［12］、SSR（Simple sequence repeat）［13-14］、CDDP（Conserve DNA-derived polymorphism）［15］、核 DNA与叶绿体 DNA分子标记［16］、ISSR（Innter-simple sequence repeat）［17］等分子标记技术对牡丹种和栽培品种群的遗传多样性进行了研究，但研究结果并不完全一致，这可能是由于在研究过程中使用了不同的试验材料以及所选择的样本数量和分子标记的种类不同所致。

以SSR为代表的第二代分子标记成为牡丹中最重要的分子标记类型［18］。SSR是真核生物基因组基因编码区和非编码区广泛分布的序列较短且重复出现的核苷酸序列，通过特异性引物对SSR两端相对保守的单拷贝序列进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，因重复序列数目或重复程度不同而呈现多态性［19］，具有多态性丰富、突变率高、重复性好、共显性和操作简便等优点［8］。前人对牡丹SSR标记进行了开发，并广泛应用于牡丹遗传多样性研究、种质鉴定、栽培种质起源与关系分析、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、组培后代遗传稳定性研究等方面［13-14，20-31］。牡丹SSR分子标记的开发与应用，可为推动牡丹分子标记辅助选择育种，提高育种效率奠定良好基础［18］。

由于牡丹基因组庞大且非常复杂，尽管对SSR标记进行了大量开发，但是尚不能达到覆盖全基因组的水平，且在牡丹中经验证的有效SSR标记相对有限，其能够应用于品种DNA指纹图谱和分子标记辅助选育的数量仍相对有限，限制了SSR分子标记技术在牡丹育种中的应用。本研究采用自主开发的SSR标记对不同品种群牡丹进行遗传多样性分析，以期获得可用于牡丹种源鉴定的有效SSR标记，为牡丹遗传图谱构建及分子标记辅助育种奠定理论和技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为分别来自中原、国际、西南、西北、江南牡丹品种群的30个品种（表1），样品均取自国际牡丹园。采集各品种春季刚长出的、自上往下数第3—4片新鲜叶片，迅速置于液氮中冷冻后，带回实验室置于-70℃冰箱中保存备用。

1.2 SSR引物开发

试验所用SSR引物均为自主开发，采用HiSeq2000高通量测序仪对中原牡丹品种‘洛阳红’和‘乌龙捧盛’进行测序，使用 MicroSAtellite（MISA，http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）发掘 SSR位点，使用Primer3对获得的SSR进行引物设计，随机挑选22对引物（表2）进行不同品种群牡丹SSR标记的遗传多样性及聚类分析。

1.3 基因组DNA提取与PCR扩增

采用百泰克植物基因组DNA提取试剂盒提取牡丹基因组DNA，紫外分光光度计定量DNA，各品种随机选取5份DNA样品等量混合用于 PCR扩增。PCR反应体系：正反引物各0.5μL（10μmol/L），ddH2O 3μL，DNA 1.0μL（20 ng/μL），Premix 5μL（TaKaRa）。PCR反应程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，54℃30 s，72℃1 min，30个循环；72℃10 min。取扩增产物2μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，选取具有多态性的位点，剩余产物通过8%聚丙烯酰胺凝胶检测进行基因分型与条带读取［29］。

表1 不同品种群牡丹品种及其表型特征Table 1 Tree peony cultivars of different group and their phenotypic traits

表2 SSR引物信息Table 2 Information of SSR primers

1.4 数据处理

SSR引物扩增后清晰可辨可重复条带记为“1”，同一位置缺失记为“0”，建立原始数据矩阵。采用Popgene 1.32计算每对引物扩增位点等位位点数、多态性信息量、获得各物种间遗传距离和相似性系数矩阵［32］。在遗传相似系数基础上，利用 NTSYS-pc（Ver 2.1）按非加权平均法（UPGMA）进行聚类分析［33］。

2 结果与分析

2.1 主要农艺性状表现

试验所选用的牡丹大部分为中晚花品种，其株型为直立开张，花型多为菊花型、蔷薇型及单瓣型，花色差异稍大，分属于红、白、粉、黄、蓝、紫、黑大色系（表1）。

2.2 SSR引物筛选及评价

采用MISA对高通量二代测序获得的81 725个unigenes进行SSR发掘，共获得8 663个SSR，使用随机选取的22对引物，对30个来自不同品种群的牡丹供试样品进行PCR扩增，所有引物均能扩增出清晰条带并表现出多态性差异，共获得90个等位基因，多态位点的等位基因数（N a）为2—6个，平均等位基因数为4.09个，其中P2位点等位基因数为6个。Shannon’s多样性指数（I）范围为0.1584—1.4000，平均为0.9731，Nei’s基因多样度（H）范围为0.0713—0.7469，平均为0.5250。表观杂合度（Ho）、期望杂合度（He）变化范围分别为0.1481—1.000（平均 0.528）、0.0727—0.7908（平均 0.5379）。22个多态位点 PIC（Polymorphic Information Content）值介于0.0713—0.7569，平均为0.5250，其中有16个高度多态位点（PIC＞0.5）、2个中度多态位点（0.25＜PIC＜0.5）、4个低度多态位点（PIC＜0.25）（表3）。

表3 22对SSR引物的多态检测Table 3 Polymorphic detection of 22 pairs of SSR primers

2.3 牡丹不同品种群品种资源的遗传相似系数分析

以遗传距离矩阵为分析对象，根据SSR标记计算亲本间遗传相似系数，得到30个品种遗传相似系数为0.1750—0.9643，平均值为0.4990。其中，‘粉莲’和‘渡世白’遗传相似系数最小，为0.1750，表明二者亲缘关系最远；其次为‘蓝线女’和‘时雨云’，为0.1865。‘轻罗’和‘雀好’遗传相似系数最大，为0.9643，表明二者亲缘关系最近，其次为‘昌红’和‘轻罗’，为0.9316（表4）。研究结果表明：不同牡丹品种群间的遗传相似性较小，而同一品种群间遗传相似系数较大，遗传差异性不大。

表4 不同品种群部分牡丹品种遗传距离和相似系数Table 4 Genetic distance and sim ilarity coefficient of several tree peony cultivars of different group

2.4 SSR位点对不同品种群牡丹品种的聚类分析

聚类分析结果表明：相似系数为0.68时可将30个牡丹品种聚成Cluster I和Cluster II两大类。Cluster I又可分为Subcluster I和Subcluster II两个亚类，Subcluster I的Group A1包括中原品种和国际品种，Group A2中除中原品种和国际品种外，还包含西北品种‘红莲’；Subcluster II的Group B1中包括国际品种和中原品种‘飞雪迎夏’，而Group B2仅包含西北品种（图1）。Cluster II由西南品种和江南品种组成，可分为 Subcluster III和 Subcluster IV。隶属西南品种群的‘天蓬牡丹’单独聚为 Subcluster III；Subcluster IV的Group C1被分为Subgroup D1和Subgroup D2，其中Subgroup D1仅包含西南品种群的‘粉莲’，Subgroup D2中，西南品种群的‘金腰梅’聚为一类，剩余6个隶属江南品种群的牡丹品种‘轻罗’‘昌红’‘雀好’‘呼红’‘燕江红’‘西施’聚为一类，Subcluster IV的Group C2中隶属江南品种群的‘四旋’单独聚为一类（图1）。

图1 不同品种群30个牡丹品种的SSR聚类分析Fig.1 Cluster analysis of 30 tree peony cultivars based on SSR markers

3 结论与讨论

牡丹品种繁多且新品种不断开发，导致其种质资源遗传多样性研究愈加困难。因此，牡丹种质资源遗传多样性研究至关重要。SSR具有简便高效的特点，可通过同源比对获得转录本差异，在遗传多样性分析、分子标记辅助选择育种中具有较高的应用价值［34-36］。数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST）已公开的牡丹EST序列，为牡丹SSR标记的开发提供了丰富而宝贵的资源。本研究共获得22对SSR多态性引物，丰富了牡丹SSR来源。李美琴等［37］报道SSR位点重复基元多为二、三碱基重复，说明在SSR开发过程中2—4个核苷酸重复基元的开发成功率相对较高，而本研究开发的SSR位点多为五碱基重复的SSR位点。

表观等位基因数（N a）是衡量SSR位点多态性的重要指标，其大小与研究对象遗传特性有关［38］。本研究中来自5个品种群的30个牡丹品种在22个SSR位点上的平均表观等位基因数为4.09，高于多态性引物在牡丹品种间的等位基因位点数目［24-25，31］。Wu等［23］对牡丹的多态性评估表明，N a变化范围为3—12，平均为7.4。Shannon’s多样性指数（I）是评价遗传多样性的重要指标。本研究中，来自5个品种群的30个牡丹品种在22个SSR位点上的Shannon’s多样性指数（I）为0.9731。上述多项指标表明，本研究中5个品种群的30个牡丹品种遗传多样性水平较高。

PIC值是衡量群体变异程度的重要参数，是基于所检测到的等位基因数目及分布频率，其大小取决于所用引物数目和被扩增基因型的数目，在一定意义上是检测引物多态性能力的度量。引物PIC值越高，它所揭示的等位基因变异能力就越强［34］。本研究中22个SSR多态位点的PIC值介于0.0713—0.7469，平均值为0.5250，说明本研究所用的SSR引物在其变异丰富的测试品种中多态性较高。

利用已开发的SSR引物鉴定牡丹种质资源遗传关系，发现西北品种群‘紫斑’牡丹与西南品种群的四川牡丹紧密相关［23，39］。研究发现，‘紫斑’牡丹是西北品种群的祖先［25，29］。‘二乔’‘姚黄’‘豆绿’‘琉璃冠珠’等国际品种与中原品种群聚在一起，说明国际品种起源于中国的中原牡丹品种群［24-25，40］。牡丹野生种是否均参与栽培牡丹的起源观点尚不统一［41］。本研究发现，相似系数较高的栽培品种聚在一起，说明其亲缘关系较近。

蔡长福［42］利用19对SSR引物对牡丹3个杂交组合进行遗传多态性分析，发现‘凤丹白’ב红乔’杂交组合亲本间DNA水平的多态性最高，19对SSR引物共检测到27个多态性位点，亲本间遗传距离为0.7070，说明这些SSR引物可以用于杂交后代的早期鉴定。本研究开发的SSR来自于不同中原牡丹品种转录组测序结果，22对SSR引物在不同牡丹品种群牡丹的自然群体中具有多态性，本研究可为牡丹SSR标记的开发与鉴定补充资源。

牡丹具有重要的观赏、药用和食用价值，其核心种质特性了解较少，重要性状定位等遗传研究薄弱，现有栽培品种的分离纯化，可为优良品种选育提供基因资源。本研究共开发22对SSR标记，其基因组检测结果表现为条带清晰可辨，表明这些SSR标记具有多态性，22对SSR标记能有效鉴定牡丹种质资源的遗传多样性，研究结果可为探究牡丹遗传多样性和牡丹资源保存提供理论依据。

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