猪MII期卵母细胞冷冻前后全基因组表达谱分析

戴建军，吴彩凤，张树山，孙玲伟，陈亚宁，张德福*

(1上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海 201106；3上海种猪工程技术研究中心，上海 201302)

继1972年Whittingham等[1]首次报道冷冻小鼠胚胎并获得存活后代以来，冷冻保存技术已经在超过20个物种中得到了广泛的应用。然而不同的物种之间，其胚胎或卵母细胞的抗冻能力不一致。在牛、羊上，其玻璃化冷冻保存已经获得了较大范围的推广应用，然而猪卵母细胞和胚胎的冷冻效率至今仍较低[2]，冷冻损伤机理研究十分迫切。

玻璃化冷冻可对卵母细胞或胚胎造成超微结构[3]、细胞器功能[4]和相关功能基因表达[5-6]的影响，目前常用电子显微镜、共聚焦显微镜和RT-PCR等方法进行检测。然而细胞的生命活动是一个非常复杂的生理生化过程，很难通过这类常规检测对整个生理生化过程进行系统评估。基因组表达谱芯片具有灵敏、高效、平行化、高通量等优点，通过筛选特异性表达基因，可在基因水平上揭示胚胎发育过程的本质，并在胚胎工程研究中被广泛应用。目前将芯片技术应用在胚胎方面的研究物种包括人、鼠、牛、猪和山羊等[7]。

目前，已见小鼠[8]、兔[9]和牛[10]的冷冻胚胎的全基因组表达谱分析的相关报道，但未见猪卵母细胞冷冻前后全基因组表达谱分析的相关研究。本研究拟利用Affymetrix猪的全基因组表达谱芯片，对玻璃化冷冻前后的猪MII期卵母细胞进行全基因组表达谱分析，为深入探究其冷冻损伤机理奠定基础，丰富其低温生物学的研究内容。

1 材料与方法

除特别说明外，本研究所用试剂均购自美国Sigma公司。

1.1 卵母细胞的采集和体外成熟

于上海五丰公司屠宰场采集初情期前的猪卵巢，置于含500 IUmL双抗的37 ℃生理盐水中，2 h内运回实验室。用18号针头注射器收集卵丘卵母细胞复合体(COCs)，沉淀30 min后取沉淀物，在显微镜下挑选有3层以上颗粒细胞且胞质均匀的COCs，经台氏液和TCM-199(Gibco，美国)洗涤后置于预温平衡的体外成熟培养液(IVM)中培养。体外成熟培养液配方为：TCM-199中分别添加10%(vv)胎牛血清(Gibco，美国)、10%(vv)猪卵泡液(实验室自制)、10 IUmL孕马血清促性腺激素(宁波市第三激素制品有限公司，中国)、10 IUmL人绒毛膜促性腺激素(宁波市第三激素制品有限公司，中国)、100 IUmL双抗、0.1 mgmL的L-半胱氨酸和10 ngmL表皮生长因子。培养条件为：38.5 ℃，5% CO2浓度，饱和湿度。培养44 h后的COCs用0.1%的透明质酸酶反复吹打和消化，在显微镜下挑出排出第一极体的卵母细胞用于后续试验。同一批次卵母细胞均随机分为新鲜组和OPS玻璃化冷冻组进行试验。

1.2 OPS玻璃化冷冻与解冻

在39℃的恒温操作台上，MII期卵母细胞在冷冻保护剂Ⅰ(TCM199中含7.5%的乙二醇，7.5%二甲基亚砜和10%胎牛血清)中处理5 min，然后转入冷冻保护剂Ⅱ(TCM199中含17%乙二醇，17%二甲基亚砜，10%胎牛血清和0.4 molL蔗糖)中处理15 s，装入OPS管，30 s内投入液氮保存。解冻时，分别在0.5 mmolL和0.25 mmolL的蔗糖中平衡5 min，然后移入TCM199中洗2遍，备用。冷冻卵母细胞在含10% FBS的TCM199中孵育2 h后进行收集，每150枚卵母细胞为一个重复样本，单独保存于-80℃冰箱中用于RNA提取。新鲜组则挑取同一批次150枚新鲜成熟卵母细胞，于-80℃保存后用于RNA提取。

1.3 冻后卵母细胞存活和孤雌激活发育能力检测

1.4 卵母细胞总RNA的提取

-80℃保存的新鲜和冷冻卵母细胞用于总RNA提取，采用 RNApreo Pure微量样品总RNA提取试剂盒(TIANGEN)进行RNA提取，用微孔板分光光度计进行RNA浓度检测，选取A260A280 在1.9—2.1，质量浓度大于5 ngμL的RNA溶液用于总RNA的整体扩增。整体扩增使用TargetAmpTM2-Round aRNA Amplification Kit 2.0试剂盒进行。

1.5 芯片杂交、扫描和数据分析

新鲜组和OPS玻璃化冷冻组分别取3个重复，每个样本分别取100 ng的上述总RNA，利用RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen)纯化得到mRNA。目的RNA的准备和芯片杂交、扫描和初步分析处理参照GeneChip®3’ IVT Expres Kits的标准流程进行。GeneChip®Porcine Genome Array来源于Affymetrix公司。

采用Affymetrix 公司提供的Expression Console软件进行Robust Multichip Analysis(RMA)分析，根据样品分组，进行组间统计学ANOVA比对分析，得到组间大于2倍差异表达的基因，筛选出新鲜组和OPS玻璃化冷冻组差异表达基因。

对差异表达基因进行显著性富集分析(Gene ontology，GO)和KEGG Pathway分析。

1.6 部分差异表达基因的qRT-PCR验证

冷冻和新鲜卵母细胞经RNA提取和反转录，应用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)在代表性基因中随机选择3个上调和3个下调表达基因(激酶和转移酶活性相关基因MAP3K7，细胞骨架相关基因ARPC2和MYL6，脂多糖结合蛋白相关基因LBP和线粒体功能相关基因COX6C、POLG)进行表达验证。引物信息如表1所示。反应体系：cDNA 模板2.0 μL、SYBR Premix Ex Taq II 10 μL、Forward Primer 0.8 μL、Reverse Primer 0.8 μL、ROX II 0.4 μL、加RNase-Free ddH2O补至20 μL。反应条件：预变性95℃ 30 s，变性95℃ 5 s，退火34 s(Tm均为55℃)，72℃延伸30 s，循环35次，退火处收集荧光。在ABI 7500实时荧光定量PCR 仪上运行。冷冻和新鲜卵母细胞各选择3个样本，每个样品重复3次。

表1 RT-PCR 引物信息

1.7 生物统计

qRT-PCR以GAPDH为内参基因，新鲜组和冷冻组各基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算比较。卵母细胞发育能力采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 冷冻对猪MII期卵母细胞存活和体外发育能力的影响

玻璃化冷冻对猪MII期卵母细胞存活率和孤雌发育能力的影响见表2。OPS玻璃化冷冻后其FDA染色存活率(72.50%)显著低于新鲜组(98.00%)(P<0.05)。OPS冷冻卵母细胞解冻后经孤雌激活，取得了14.56%的卵裂率和4.85%的囊胚率，显著低于新鲜组的80.91%和35.45%(P<0.05)。

表2 冷冻对猪卵母细胞存活和孤雌激活发育的影响

同列不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.2 冷冻卵母细胞全基因组表达谱芯片研究

将OPS玻璃化冷冻组数据与新鲜卵母细胞组数据进行比较，筛选出171个2倍以上差异表达基因，其中上调表达基因103个，下调表达基因68个。部分代表性差异表达基因见表3。

2.3 部分差异基因的qRT-PCR表达验证

如图1所示，与新鲜卵母细胞相比，MAP3K7 、ARPC2和LBP基因的表达水平在冷冻卵母细胞中分别上调2.98倍、1.92倍和2.65倍，COX6C、POLG和MYL6基因的表达水平分别下调5.64倍、3.26倍和4.85倍，所得结果与基因芯片基本一致。

图1 差异表达基因的qRT-PCR验证Fig.1 qRT-PCR validation of differentially expressed genes

2.4 芯片结果的系统聚类分析和主成分分析

如图2所示,3个新鲜组样品和3个玻璃化冷冻组样品组内相似性较好，而组间的基因表达具有一定的差异性。

图2 系统聚类分析和主成分分析Fig.2 Hierarchical clustering analysis and principle component analysis

2.5 冷冻后上调差异表达基因的GO分析

卵母细胞冷冻后上调差异表达基因的生物过程(Biological process，BP)、细胞组成(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)的GO分析结果见图3。结果显示，上调表达基因涉及损伤应答、有机物反应、蛋白激酶调节、细胞增殖、细胞凋亡和细胞坏死调节等生物过程。同时还涉及胞外区、基底质膜、细胞外间隙、质膜、肌动蛋白细胞骨架等细胞组成调控和类固醇结合、酶抑制剂的活性、蛋白质复合物结合、激素结合和转录因子活性等分子功能调控。

图3 上调差异表达基因的GO注释Fig.3 GO annotation of up-regulated differentially expressed genes

2.6 冷冻后下调差异表达基因的GO分析

卵母细胞冷冻后下调差异表达基因的生物过程、细胞组成和分子功能的GO分析结果见图4。结果显示，下调表达基因涉及RNA拼接，核mRNA拼接，mRNA 代谢，转运正向调节和细胞增殖等生物过程。同时还涉及线粒体脊、线粒体、细胞器膜、线粒体包膜和剪接体等细胞组成调控和核苷酸结合、FAD结合、辅酶结合、固醇转运活性、核苷酸转移酶活性和ATP酶活性等分子功能调控。

图4 下调差异表达基因的GO注释Fig.4 GO annotation of down-regulated differentially expressed genes

2.7 冷冻后差异表达基因的KEGG Pathway分析

猪MII期卵母细胞玻璃化冷冻后有显著性差异的KEGG Pathway分析结果见图5。差异表达基因涉及Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、黏着连接和MAPK信号通路等。

图5 差异表达基因KEGG Pathway—(-LgP)柱状图Fig.5 Histogram of KEGG Pathway—(-LgP)for differentially expressed genes

3 讨论

卵母细胞和胚胎的发育过程是由基因控制的复杂过程，然冷冻可造成其基因表达水平的异常变化[5,8]。本研究利用Affymetrix猪商业化表达谱芯片对冷冻前后的猪卵母细胞的全基因组表达谱进行了研究，获得了已获注解的2倍以上差异表达基因171个，这为今后筛选得到更多的冷冻相关基因提供了丰富的基础数据。

在这些差异表达基因中，冻后下调倍数最高的是SLC25A3基因，达38.583倍，该基因是编码Pic基因的重要组成部分，而Pic则是线粒体内膜上的一个重要功能蛋白，在线粒体膜通道孔打开中发挥重要作用[11]。在文中所列的其他差异表达基因中，ATP2A2、VDAC2、COX6C、POLG、PPARGC-1等均与线粒体功能密切相关。研究表明，冷冻可造成猪MII期卵母细胞线粒体功能的系统性损伤，包括超微结构异常、膜电位下降、ATP水平降低和抗氧化能力减弱等[4]与本研究结果一致。本研究中上调倍数最高的基因为NPPC，上调倍数为3.64317。该基因在抑制卵母细胞的减数分裂中发挥重要作用[12]，验证了本研究中冻后发育能力显著下降这一结果。

在上调差异表达基因的生物学过程GO分析中，排名第一的为损伤应答(Responese to wounding)。冷冻作为一种强刺激源，使细胞受到严重的破坏和损伤，从而使细胞对损伤做出迅速的反应，这为日后冷冻损伤的机理研究提供了新的方向。本研究中凋亡、细胞程序性死亡和细胞坏死调节也是参与基因上调表达的重要生物学过程。研究表明，在卵母细胞和胚胎冷冻中，细胞凋亡被认为是发育能力下降的主要因素之一[13-14]，且死亡受体介导的外源性凋亡途径和线粒体介导的内源性凋亡途径共同导致了凋亡的发生[15]。此外，有机物反应和蛋白激酶调节等生物学过程也参与了冻后卵母细胞的基因调控，相关研究值得后续进一步深入。

在上调基因的细胞组分分析中，胞外区、基底质膜、细胞外间隙、质膜、肌动蛋白细胞骨架等参与了其冷冻后上调基因表达调控。冷冻作为一种外源性刺激因子，其首先对细胞外区域产生重大影响，因此胞外区分离和细胞外间隙的细胞组分影响排在细胞组分分析的前列。冷冻能对细胞质膜产生严重破坏，这一点已经在众多的研究中得到了证实[16]。冷冻还对卵母细胞的细胞骨架产生影响[17]，本试验中上调基因的细胞组分分析中，有6个上调表达基因参与了肌动蛋白细胞骨架的调控。

卵母细胞冷冻后下调差异表达基因的生物过程分析中，RNA拼接、核mRNA拼接和mRNA 代谢等参与了冷冻后下调基因表达的生物过程调控。MII期卵母细只能通过其自身储备的RNA和mRNA来合成相关蛋白，其本身并不能转录RNA，故其RNA丰度对随后的胚胎发育有重要作用[18]。本研究芯片结果表明，卵母细胞玻璃化冷冻一方面通过影响卵母细胞内RNA和mRNA的剪接而影响其生物学过程，另一方面通过干扰其mRNA代谢，降低其自身RNA储备影响基因表达。在本研究的下调基因细胞组分分析中，与线粒体功能密切的组分占了最主要部分，包括线粒体脊、线粒体、细胞器膜和线粒体包膜等，说明冷冻对线粒体功能产生了巨大影响。已有研究表明，冷冻会对卵母细胞的线粒体功能产生破坏[19]，玻璃化冷冻会对猪卵母细胞线粒体超微结构、分布和膜电位产生负面影响[4]，这些结果与本研究中下调功能基因的细胞组分分析结果相一致。

在冻后差异表达基因的KEGG Pathway分析中，Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、黏着连接和MAPK信号通路参与了差异表达基因的调控通路。Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路在机体免疫系统[20]和抗感染[21]中发挥重要作用，冷冻对细胞的损伤和刺激可能诱导了该信号通路的发生，相关研究需进一步深入。黏着连接是细胞中的一个重要连接方式，是一种有细胞骨架参与的紧密连接方式，与细胞信号转导密切相关[22]。冷冻中黏着连接上调信号通路的参与可能与细胞骨架相关基因上调表达相关。MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究证实，MAPK信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内并引起细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)的过程中具有至关重要的作用[23]。冷冻后，MAPK信号通路调控参与其中，表明冷冻对卵母细胞随后的存活率和发育能力将产生严重的影响。

4 结论

本研究利用猪全基因组表达谱芯片分析了猪MII期卵母细胞冷冻前后的基因表达差异，筛选出了171个差异表达基因。聚类分析和KEGG Pathway分析发现细胞损伤应答、凋亡、细胞坏死、细胞质膜、细胞骨架、mRNA拼接和线粒体功能等多种生物学过程参与了冻后卵母细胞的发育异常。本研究为进一步探究猪卵母细胞冷冻损伤机理提供了基础数据。