基于SSR标记的鲜食玉米自交系遗传多样性分析

张微微，张红伟，王 慧，陈 岳，周 鹏，李 炯，俞平高*（上海农林职业技术学院园艺园林系，上海0699；上海粒粒丰农业科技有限公司，上海0600；上海市农业科学院作物育种栽培研究所，上海00；东北农业大学园艺学院，哈尔滨　5000）

基于SSR标记的鲜食玉米自交系遗传多样性分析

张微微1，张红伟2，王 慧3，陈 岳4，周 鹏1，李 炯2，俞平高1*
（1上海农林职业技术学院园艺园林系，上海201699；2上海粒粒丰农业科技有限公司，上海201600；3上海市农业科学院作物育种栽培研究所，上海201403；4东北农业大学园艺学院，哈尔滨150030）

从103对SSR引物中筛选出42对稳定扩增的多态性SSR引物，多态性比率为40.8%，并对117份玉米自交系的亲缘关系进行评价。结果表明：42对SSR标记共扩增出171个等位基因，每个标记位点等位基因数从2到8个，平均等位基因数为4.1，多态性信息量（PIC）值范围从0.73到0.90，平均每对引物0.82。用UPGMA方法将117份玉米自交系划分为3个类群，划分结果与其系谱来源基本相符。

玉米；鲜食玉米；自交系；遗传多样性；SSR标记

玉米自交系是玉米人工进化的重要产物，在遗传学研究和育种工作中具有重要的价值。目前大多选育的玉米自交系品种没有系统的系谱记载，降低其在杂种优势群体构建的利用率及育种效率。因此，研究玉米自交系的遗传变异及其之间的亲缘关系，从而进行类群划分是构建玉米杂种优势群的重要依据，是提高选育优良杂交种效率的基础性工作。

传统育种多是通过表现型间接对基因型进行选择，存在很大的盲目性和随机性，然而分子标记技术的发展为评价玉米种质基础及杂种优势利用提供了新手段。SSR（Simplesequence repeat）标记是建立在PCR（Polymerase chain reaction）反应基础之上的一种遗传标记，已有效地应用于玉米种质的遗传学研究。李新海等［1］利用SSR标记研究了21个玉米自交系的遗传变异。刘杰等［2］采用SSR和杂种优势聚类方法分析我国15个玉米自交系的遗传变异，并初步进行了杂种优势类群划分。刘世建等［3］对四川地方玉米种质进行了SSR聚类分析，研究了28个玉米自交系的遗传变异。李丽华等［4］对59份新选玉米自交系利用SSR标记技术研究其遗传多样性。乔志军等［5］对180份玉米自交系亲缘关系进行了分子评价。吉琼等［6］利用SSR标记研究了96个玉米自交系的遗传多样性。虽然利用SSR标记进行遗传多态性分析和杂种优势群划分方面已有一些研究报道，但目前对玉米自交系（尤其上海地区）遗传多样性分析的研究还较少。因此，本研究利用文献及玉米基因组数据库（MaizeGBD）查找开发SSR标记，对117份上海粒粒丰农业科技有限公司的主要玉米自交系遗传多样性进行了系统分析，以期为玉米种质扩增改良与创新研究等育种工作提供技术支撑，同时为充分挖掘种质资源的遗传潜力提供依据。

1　材料与方法

1.1植物材料

试验种质是上海粒粒丰农业科技有限公司收集及自选系包括甜玉米和糯玉米，共计117份玉米自交系形成的供试群体（表1）。于2015年4月在上海粒粒丰农业科技有限公司实验基地种植，常规播种，于5月份对每个自交系进行取样，-80℃保存备用。

表1　117份玉米自交系信息Table 1　Data of 117 maize inbred lines

（续表1）

1.2玉米基因组DNA的提取

取玉米鲜样（幼嫩叶）0.1g，用液氮磨成粉状，然后用DNA提取试剂盒（DP320，北京天根）提取基因组DNA。DNA提取后于1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳缓冲液为1×TAE，电压100V；DNA纯度和浓度测量利用NanoDrop2000c紫外可见光谱仪（Thermo公司）进行测定，稀释至50ng/μL的工作液备用，4℃冰箱储藏。

1.3SSR标记

PCR扩增反应总体积为10μL，其中反应混合液中包括：5μL的2×ESTaqmix（康为公司），DNA（50 ng/μL）模板1μL，引物0.5μL（10μmol/L），3.5μL的ddH2O。PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物中加入6μL变性剂，94℃变性5 min，迅速放于冰上冷却，于6%聚丙烯酰胺凝胶检测，银染法显色。白炽灯下观察电泳结果，进行数据统计和照相。试验所用SSR引物均由生工生物工程股份（上海）有限公司合成。

1.4数据分析

扩增产物以0、1、-统计建立数据库。在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，缺失数据记为-。数据分析采用NTSYS-pcv 2.11软件进行，以Jaccard计算遗传相似系数，利用非加权组平均法（UPGMA）对117份玉米自交系进行聚类分析，构建分子系统树，FREETREE用于计算。多态性信息量（Polymorphism information content，PIC）计算方法参照Botstein等［7］。

2　结果与分析

2.1SSR标记多态性分析

图1　SSR引物对玉米自交系扩增的电泳结果Fig.1　Electrophoretic result of amplification of inbred lines bysSR primers

本研究于103对SSR引物中筛选出42对扩增稳定、具有多态性的SSR引物（图1），多态性比率为40.8%。42对多态性SSR引物对117份玉米自交系进行PCR扩增，结果表明共扩增出171条多态性条带，每个标记位点等位基因数从2到8个，平均等位基因数为4.1；多态性信息量（PIC）是用来评估每对引物标记的多态性信息量水平，本试验筛选出的42对SSR引物中，PIC值范围从0.73到0.90，平均每对引物0.82，表明所筛选引物具有较丰富的遗传多样性（表2）。

表2　42对多态性　SSR引物信息Table 2　Information of 42-pair polymorphicsSR primers

2.2遗传多样性分析

根据42对SSR引物的扩增结果，共171个多态性位点用于计算117份玉米自交系间的遗传相似系数，遗传相似系数范围为0.69—0.98，其中以M1363与M1364的相似系数最大（0.98），聚类结果表明所选玉米自交系间具有较丰富的遗传变异。在遗传相似系数为0.70时，可以将117份供试自交系分为3大类群（I，II和III）（图2）。第I类群基本包含甜玉米，II和III两个类群都是糯玉米。

第I类群包括19个自交系，包含大部分甜玉米品系，主要是华珍母本、台湾杂交种来源的选系。这些材料多是热带血缘，较抗南方锈病，生育期相对温带材料较长。第II类群包括86份自交系，根据其来源、田间表现及育种过程中配合力历年数据，又可分为两个亚群：第1亚群主要是以‘京科糯2000’父本为基础材料进行的改良系，其中有两种主要遗传改良方向，一是‘京科糯2000’父本与美国来源的遗传资源进行小群体轮回选择群体改良的后代选系，二是‘京科糯2000’父本与市售优良杂交种进行遗传改良的材料，该群遗传改良的目的是提高京科糯2000株系的抗倒性及进行双隐性自交系亲本的培育；第2亚群包括17份自交系（M1238—M1369），主要是来源于地方品种LJZ改良系，该群材料配合力优秀，果穗结实性好，单穗产量较高，植株半紧凑，抗倒性好，缺点是穗轴较粗，目前是我们进行重点选育改良的材料；第III类群包括12份自交系，主要是来自于先正达杂交种的群体改良选系材料。

图2　117份玉米自交系聚类分析树状图（UPGMA法）Fig.2　Dendrogram of 117 inbred lines based on cluster analysis by UPGMA method

3　讨论

SSR标记是指由2—6个碱基对组成简单重复序列串联组成的短片段，是基于PCR反应的共显性的遗传标记［8］。该技术简便快速、重复性好、稳定性高和等位基因多态性丰富等优点，已广泛用于玉米的遗传图谱构建、基因定位、分子标记辅助育种及遗传多样性分析等方面研究［9-11］。本研究利用42对多态性SSR引物在117份玉米自交系中检测到171条多态性条带，平均等位基因数为4.1和平均PIC为0.82，这与XIE等［12］所报道的70对sSR标记在187自交系中检测到的平均等位基因数（4.14）相同，但平均PIC （0.615）低于本试验；并均高于肖木辑等［13］采用70对SSR引物对37份辽宁省主要玉米自交系检测的平均等位基因数（3.7）和平均PIC（0.564），这可能与试验材料和所选引物有关。本试验所用引物平均PIC均高于文献报道，表明所筛选引物具有较丰富的遗传多样性。

传统玉米自交系类群的划分主要依赖于系谱和杂交组合的产量来划分杂种优势群体，因此，通过分子标记技术研究自交系的遗传背景和关系，对改良玉米自交系和组配杂交组合均有很高的参考价值，以往的研究表明SSR能较真实地揭示自交系间的遗传多样性。本研究选用42对SSR引物将117份玉米自交系基本分开，结合分析供试自交系的系谱来源，发现划分类群与其种质来源基本一致，但也有一些自交系与系谱记载并不符合，少部分来自同一基础材料的自交系被归入不同类群，原因可能在于这些基础材料存在较大的遗传变异、原始种质混杂或实验误差等。事实上，利用分子标记划分玉米自交系，不能简单地以与系谱分析吻合为标准，关键还是看能否指导预测玉米杂种优势。目前对玉米自交系（尤其上海地区）遗传多样性分析的研究还较少，因此，本研究使用分子标记辅助育种划分杂种优势群，进行优势组合的选配，可以选育出适合在上海生长的优良品种，以期为玉米种质扩增改良与创新研究等育种工作提供技术支撑，同时为充分挖掘种质资源的遗传潜力提供依据。

［1］李新海，傅骏骅，张世煌，等.利用SSR标记研究玉米自交系的遗传变异［J］.中国农业科学，2000，33（2）：1-9.

［2］刘杰，陈刚.SSR标记用于玉米自交系遗传变异与优势类群划分的研究［J］.西北植物学报，2002，22（4）：741-750.

［3］刘世建，荣廷昭，杨俊品，等.四川玉米地方种质的SSR聚类分析［J］.作物学报，2004，30（3）：221-226.

［4］李丽华，魏昕，潘光堂，等.新选优良玉米自交系SSR遗传多样性分析［J］.玉米科学，2009，17（4）：24-28.

［5］乔志军，刘龙龙，南晓洁，等.180份玉米自交系亲缘关系的分子评价［J］.植物遗传资源学报，2011，12（2）：211-215.

［6］吉琼，张新玲，童婷，等.利用SSR标记研究96个玉米自交系的遗传多样性及其群体遗传结构［J］.新疆农业大学学报，2012，35（2）：99-106.

［7］BOTSTEINd，WHITE R L，SKOLNICK M，et al.Construction of agenetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms ［J］.American Journal of Humangenetics，1980，32（3）：314-331.

［8］POWELL W，MACHRAYg C，PROVAN J.Polymorphism revealed bysimplesequence repeats［J］.Trends in Plantscience，1996，1（7）：215-222.

［9］向道权，曹海河，曹永国，等.玉米SSR遗传图谱构建及产量性状基因定位［J］.遗传学报，2001，28（8）：778-784.

［10］INGHELANDTd V，MELCHINGER A E，LEBRETON C，et al.Populationstructure andgeneticdiversity in a commercial maize breeding program assessed withsSR andsNP markers［J］.Theor Applgenet，2010，120：1289-1299.

［11］刘章雄，王守才，戴景瑞，等.玉米自交系抗锈病基因的遗传分析及SSR分子标记定位［J］.遗传学报，2003，30（8）：706-710.

［12］XIE C，ZHANGs，LI M，et al.Inferringgenome ancestry and estimating molecular relatedness among 187 Chinese maize inbred lines［J］.Genetgenom，2007，34（8）：738-748.

［13］肖木辑，李明顺，孙有位，等.辽宁省主要玉米自交系的SSR遗传多样性分析［J］.玉米科学，2006，14（1）：33-36.

（责任编辑：程智强）

SSR marker-basedgeneticdiversity analysis of table corn inbred lines

ZHANG Wei-wei1，ZHANG Hong-wei2，WANG Hui3，CHEN Yue3，ZHOU Peng1，LI Jiong2，YU Ping-gao1*
（1Department of Horticulture and Landscaping，Shanghai Vocational Technical College of Agriculture and Forestry，Shanghai 201699，China；2Shanghai Lilifeng Agricultural Technology Limited Company，Shanghai 201600，China；3Crop Breeding and Cultivation Research Institute，Shanghai Academy of Agriculturalsciences，Shanghai 201403，China；4School of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Of 103-pairsSR primers，42 pairs of polymorphicsSR primers ofstable amplification were identified，being 40.8%of polymorphism ratio，and then used to evaluate thegenetic relationships of 117 maize inbred lines.The resultshowed that a total of 171 alleles were amplified by the 42-pairsSRs，the number of alleles per markersite ranged from 2 to 8，averaging 4.1，and the polymorphic information content（PIC）values were 0.73—0.90，averaging 0.82 each pair of primers.The 117 maize inbred lines were classified into threegroups by the UPGMA method，and the classified result basically conformed to their pedigree analysis.

Maize；Table corn；Inbred line；Geneticdiversity；SSR marker

S513

A

1000-3924（2016）04-011-06

2016-05-18

上海高校青年教师培养项目（ZZNL15001）；上海农林职业技术学院院内项目（KY1-0000-15-01）

张微微（1981—），女，博士，高级工程师，研究方向：玉米遗传育种。Tel：021-67722810，E-mail：zhangww@shafc.edu.cn

，Tel：021-67722800，E-mail：yupg@shafc.edu.cn