干旱胁迫对转拟南芥　AtP5CS1基因羽衣甘蓝光合特性的影响

李大红，李 伟，邵海阔（黄淮学院生物工程系；黄淮学院园林中心，驻马店463000）

干旱胁迫对转拟南芥AtP5CS1基因羽衣甘蓝光合特性的影响

李大红1，李 伟1，邵海阔2
（1黄淮学院生物工程系；2黄淮学院园林中心，驻马店463000）

以转拟南芥AtP5CS1基因羽衣甘蓝和野生型（对照）为试验材料，在水分胁迫0d、2d、4d、6d和复水2d、4d条件下，研究水分胁迫和复水后叶片的气体交换、叶绿素荧光参数、叶绿素含量的变化特征。结果表明：随着水分胁迫天数的增加，转基因羽衣甘蓝的叶绿素含量、净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、蒸腾速率（Tr）、水分利用效率（WUE）、Fv/Fm等指标的下降幅度均小于对照，气孔限制值（Ls）和非光化学猝灭系数（NPQ）上升的幅度小于对照，说明转基因羽衣甘蓝的光系统在水分胁迫时受到的伤害程度要小于对照；复水后转基因羽衣甘蓝的光合参数、叶绿素荧光参数、叶绿素含量等迅速恢复，而对照的光合参数及其他参数恢复缓慢。在水分胁迫条件下，转基因羽衣甘蓝能保持良好的光合特性，复水后具有良好的生理补偿效应，是适应干旱环境的重要生理因素。

羽衣甘蓝；转基因；抗旱性；光合特性；对比试验

植物在干旱或盐渗透胁迫下，植物生长被抑制，生物量或产量下降，造成农业减产和经济损失。目前研究认为，植物会对逆境产生抵制作用，这种抗逆机制可能是脯氨酸（Pro）和甘氨酸等一些低分子量物质在渗透中起调节作用［1-4］。脯氨酸在渗透平衡中的作用可能是防止细胞膨压增加［5］。1-5-吡咯啉羧酸合酶（P5CS）是脯氨酸合成的限速酶。目前，P5CS基因已经在一些植物中被分离出来，其中最早被分离出来是豇豆P5CS基因。但不同物种中，P5CS基因可能有多个，他们的作用也是不同的［6］。例如，甘蓝型油菜中有两个P5CS基因（BnP5CS1和BnP5CS2），而且他们都能由脱落酸、盐和PEG诱导而表达增加［7］。但在拟南芥中，脱落酸、盐和干旱仅可诱导AtP5CS1的表达，而AtP5CS2不受影响［8］；在高等植物中，脯氨酸的积累可能是由其合成增加或分解减少。然而，如果脯氨酸合成关键酶P5CS的活性增加，其产物脯氨酸的生物合成将会增加，植物的抗逆性将会增强［9-11］。把一种植物的P5CS基因转到另一种植物中，可以增加脯氨酸的含量，如KAVI等［12］把VaP5CS在烟草中过表达，在干旱胁迫条件下转基因植株比非转基因亲本的脯氨酸含量增加，生物量也相应增长，也有人把PuP5CS转入烟草，其具有抗寒性［10］。其他类似的研究如马铃薯［13］、水稻［14-15］和小麦［16］。本研究组把拟南芥AtP5CS1基因转到羽衣甘蓝中，羽衣甘蓝中P5CS的表达显著增加，转基因植株在干旱迫胁下，株高、根长以及存活率等指标显著高于对照［17］。研究干旱胁迫下转基因羽衣甘蓝的光合特性变化，探讨干旱胁迫下转基因羽衣甘蓝与野生型的光合作用差异及与其耐旱性强弱，可为了解P5CS功能及培育羽衣甘蓝新品种提供参考。

1　材料与方法

1.1样品处理

转拟南芥AtP5CS1基因羽衣甘蓝T3代纯合体种子，野生型作为对照，每个株系选取20粒发芽正常、胚根整齐一致的种子，在培养箱中适应培养，选择6—8片真叶，植株生长一致，长势良好的幼苗，移栽到直径为20 cm的花盆中，盆中装有5 kg土壤（园土∶河沙=4∶1），每盆栽3棵植株。30d后停水进行干旱处理。土壤相对含水率控制在35%—45%。

分别在0d、2d、4d、6d测定各项指标。停止灌水后当天为0d，依次为2d、4d、6d，6d测定完成后开始恢复灌水。

1.2抗性植株的RT-PCR检测

选T3代转基因羽衣甘蓝和对照，干旱处理后4d，提取总RNA。RT-PCR参照文献［17］进行。

1.3叶绿素含量测定

取经处理相应时间羽衣甘蓝叶，称0.2g叶片剪碎，浸泡在10 mL 80%（v/v）酒精中，在70℃水浴30 min，在波长649 nm和665 nm使用分光光度计测定吸光度。依据下列公式计算叶绿素a、b的浓度：

Ca=13.95×A665-6.88×A649

Cb=24.96×A649-7.32×A665

两者的总浓度为叶绿素总含量，通过叶绿素浓度测定叶片叶绿素的含量：

叶绿素含量=（叶绿素浓度×进样体积×稀释倍数）/样品鲜重。

1.4光合参数测定

光合参数采用LI-COR公司生产的LI-6400便携式光合测量系统测定净光合速率（Pn），气孔导度（Gs），蒸腾速率（Tr）和胞间CO2浓度（Ci），红/蓝光量子通量密度设置为1 100 mol·m-2·s-1，每个数据测量5株，由Pn/Tr和1-Ci/Ca分别表示WUE（水分效率）和Ls（气孔限制值）。

1.5叶绿素荧光参数测定

把经过处理的植物移入暗处20 min后，对完全伸展、生长部位相同的叶片进行叶绿素荧光测定，使用仪器为叶绿素荧光参数仪。直接读出PSⅡ的原初光能转化效率（Fv/Fm）并计算非光化学猝灭系数（NPQ）。

图1　AtP5CS1基因表达的RT-PCR检测Fig.1　Assay of AtP5CS1gene expression by RT-PCR

1.6统计分析

采用SPSS 17.0和Excel软件进行数据处理和统计分析。

2　结果与分析

2.1AtP5CS1表达量的检测

试验选用actin作为内参，从图1可以看出，AtP5CS1基因的mRNA的表达水平在L1株系表达比较高，L2，L3株系表达稍弱，但对照中 AtP5CS1基因的mRNA没有表达。

2.2转基因植株与对照叶片叶绿素含量

在干旱胁迫下的植物叶片中叶绿素含量不仅与植物的光合作用直接相关，也是植物耐旱生理指标之一。因此，我们检测了干旱胁迫下转基因羽衣甘蓝和对照的叶片中叶绿素含量变化。干旱胁迫6d后，转基因植株叶绿素含量与对照有显著差异，其中L1的叶绿素含量比对照高36%，其他结果与此类似（图2）。以上结果显示，在干旱胁迫下，对照羽衣甘蓝叶的叶绿素被破坏，导致叶绿素含量下降，而胁迫天数越长，破坏越严重，但转基因植株受破坏的程度比对照低。复水后叶绿素逐渐恢复，转基因植株恢复的比对照要快。

2.3转基因植株与对照叶片光合作用参数

由图3可知，4个羽衣甘蓝株系叶片光合作用参数在干旱胁迫前没有明显差异。干旱胁迫2d后转基因羽衣甘蓝净光合速率（Pn）降低了21.5%，而对照降低了36.5%；转基因羽衣甘蓝气孔导度（Gs）降低32.4%，而对照降低了66.6%；转基因羽衣甘蓝蒸腾速率（Tr）降低了23.07%，但是对照降低了42.27%；转基因羽衣甘蓝胞间CO2浓度（Ci）降低了8.3%，对照却降低了38.6%。随干旱胁迫时间的延长，转基因植株与对照叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、蒸腾速率（Tr）和水分利用效率（WUE）均显著降低，但转基因下降幅度低于对照，有显著差异（P＜0.05），而气孔限制值（Ls）相反。胁迫时间达6d时，这些参数与处理前的差异都达到了极显著水平（P＜0.01）；在恢复供水后，转基因羽衣甘蓝株系L1、L2和L3的Pn和其他参数恢复得较快，而对照的Pn在恢复到第10天时仍然极显著低于处理前的水平。综上可知，干旱胁迫对转基因羽衣甘蓝影响显著小于对照，这与叶绿素含量的结果一致。

图3　干旱胁迫对转基因羽衣甘蓝叶片光合作用参数的影响Fig.3　Effects ofdroughtstress ondifferent-genotype kale leaves’photosynthetic parameters

2.4转基因植株与对照叶片荧光参数的变化

从图4叶绿素荧光参数的变化可以显示，干旱胁迫显著降低羽衣甘蓝叶片光系统Ⅱ（PSⅡ）的最大光化学效率（Fv/Fm），随着干旱胁迫延续，PSⅡ反应中心捕获激发能量效率逐渐下降，但转基因植株Fv/Fm高于对照，两者之间有显著差异（P＜0.05）。供水恢复后，转基因植株Fv/Fm增长幅度高于对照。

在干旱胁迫后，转基因和对照的羽衣甘蓝叶NPQ（非光化学淬灭系数）均随着干旱胁迫程度加深明显增加，对照羽衣甘蓝NPQ上升程度明显高于转基因羽衣甘蓝。干旱胁迫6d后，转基因羽衣甘蓝与对照叶绿素荧光参数的变化存在显著差异（P＜0.05）；在恢复供水后，叶绿素荧光参数可以恢复，但转基因株系L1，L2和L3叶绿素荧光参数NPQ低于对照，说明转基因植株的光合利用效率高于对照。

图4　干旱胁迫对转基因羽衣甘蓝叶片Fv/Fm和NPQ的影响Fig.4　Effects ofdroughtstress ondifferent-genotype kale leaves’Fv/Fm and NPQ

3　讨论

转基因植物是通过基因改造方法培育的品种。外源基因插入到基因组中是随机的，位置是不确定的，基因组之间可能存在相互作用。这些能导致活化的基因被沉默或者沉默的基因被激活［18］。由于目前缺乏对植物基因调控和基因相互作用的了解，基因序列被随机插入到基因组中，大多数的功能是非预期的。对转基因植物与其等位非转基因植物的生长发育、化学成分和生理过程进行比较研究，有助于揭示外源基因插入或内源性基因修饰导致非预期潜在的多效性或诱变效应［19］。本研究是对T3代的转拟南芥AtP5CS1羽衣甘蓝与野生型在干旱胁迫下的光合特性进行比较研究，以考查拟南芥AtP5CS1基因插入羽衣甘蓝后的功能。

过去研究表明，转入拟南芥 AtP5CS1基因的转基因羽衣甘蓝植株可以在干旱胁迫下有较好生长特性［17］。前人也在一些植物中获得高表达P5CS的植物［20］。但在园艺生产过程中，除了要求转基因羽衣甘蓝有较高的耐旱能力外，还应保持较好的光合特征。因此本研究对转入AtP5CS1基因的羽衣甘蓝光合特性进行研究。植物细胞中产生的脯氨酸能保持平衡，而当环境胁迫长期作用于植株，产生的较多的脯氨酸，就会引起脯氨酸的累积，从而使细胞膨压增加。当转入外源的P5CS基因，能增加细胞中的脯氨酸含量［21-22］。

光合作用的光化学反应是在类囊体膜上进行的。叶绿素荧光参数的变化可以直接反映PSⅡ的光化学能力。Fo为初始荧光，它表示不参与PSⅡ光化学反应的辐射光能，Fv/Fm表示PSⅡ原初光能转化效率。Fv与PSⅡ的原初反应过程有关，代表着PSⅡ光化学活性的大小［11］。干旱胁迫后野生型羽衣甘蓝Fv/Fm下降大于转基因植株（图3），可能是植物叶片PSⅡ反应中心出现可逆的失活或出现不易逆转的破坏较多，也可能是植物叶片类囊体膜受到损伤较多。另一方面，干旱胁迫后野生型羽衣甘蓝叶绿素含量明显降低（图2），也表明干旱胁迫后野生型羽衣甘蓝PSⅡ反应中心受到破坏或可逆失活比较严重，类囊体膜受损较多。转基因羽衣甘蓝Fv/Fm降低幅度远远小于野生型（图4），说明干旱胁迫对转基因羽衣甘蓝PSⅡ反应中心破坏程度小。

由热耗散引起的荧光淬灭称之为非光化学淬灭（Non-photochemical quenching，qN或NPQ），非光化学淬灭反映了植物把光能变为热能的效果。在干旱胁迫下，转基因羽衣甘蓝的NPQ低于对照。换句话说，转基因羽衣甘蓝可以把更多的光能用于光合作用，其光合效率高于对照。

叶片净光合速率（Pn）是衡量植物叶片光合特性的主要指标，胞间CO2浓度（Ci）是叶片光合作用反应底物，蒸腾速率（Tr）是烟草植株吸收水分和体内养分运输的动力。干旱胁迫下，野生型羽衣甘蓝叶片气孔导度（Gs）下降，蒸腾速率降低，导致胞间CO2浓度降低，净光合速率明显下降，而转基因羽衣甘蓝的降低幅度明显低于野生型羽衣甘蓝。

本试验研究表明，在干旱和复水条件下，转基因羽衣甘蓝具有较强的耐旱性和相对较高的水分利用效率，可能是因为转基因羽衣甘蓝干旱处理后，脯氨酸含量明显增加，是对照的2.4倍［17］，大量的脯氨酸的产生，促使植物细胞的渗透势降低，使植物能从外界环境继续吸收水分并维持细胞膨压，使体内各种代谢过程得以顺利完成。但是复水时间延长一定程度以后，转基因羽衣甘蓝能否仍然表现出光合优势，能否在产量上体现优势，这些问题还需进一步研究。

［1］CONG L L，ZHANG X Q，YANG F Y，et al.Isolation of the P5CSgene from reed canarygrass and its expression undersaltstress［J］.Genetics and Molecular Research：GMR，2014，13：9122-9133.

［2］GREENWAY H，MUNNS R.Mechanisms ofsalt tolerance in nonhalophytes［J］.AnnualReview of Plant Physiology，1980，31：149-190.

［3］RAI A N，PENNAs.Molecular evolution of plant P5CSgene involved in proline biosynthesis［J］.Molecular Biology Reports，2013，40：6429-6435.

［4］王丽珊，林清凡，陈兰平，等.茶树P5CS基因克隆及其在渗透和高盐胁迫下的表达分析［J］.热带作物学报，2015，36（1）：68-75.

［5］KUMAR V，SHRIRAM V，KISHOR P K，et al.Enhanced proline accumulation andsaltstress tolerance of transgenic indica rice by overexpressing P5CSF129Agene［J］.Plant Biotechnology Reports，2010，4：37-48.

［6］STRIZHOV N，ABRAHAM E，ÖKRÉSZ L，et al.Differential expression of two P5CSgenes controlling proline accumulationduringsalt-stress requires ABA and is regulated by ABA1，ABI1 and AXR2 in Arabidopsis［J］.The Plant Journal，1997，12：557-569.

［7］XUE X，LIU A，HUA X.Proline accumulation and transcriptional regulation of proline biothesynthesis anddegradation in Brassica napus［J］. BMB Reports，2009，42：28-34.

［8］FABROg，KOVÁCS I，PAVET V，et al.Proline accumulation and AtP5CS2gene activation are induced by plant-pathogen incompatible interactions in Arabidopsis［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2004，17：343-350.

［9］YAMCHI A，JAZII F R，MOUSAVI A，et al.Proline accumulation in transgenic tobacco as a result of expression of Arabidopsis Δ1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase（P5CS）during osmoticstress［J］.Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2007，16：9-15.

［10］徐博，任伟，徐安凯，等.转PuP5CS基因烟草对低温胁迫的生理响应［J］.华北农学报，2012，27（3）：186-190.

［11］曹丽，义鸣放，孙振元，等.多年生黑麦草P5CS基因的定点突变及其在拟南芥中的转化［J］.草业学报，2011，20（1）：242-247.

［12］KAVI KISHOR P，ZONGLIE H，MIAOg H，et al.Overexpression of Δ1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants［J］.Plant Physiology，1995，108：1387-1394.

［13］HMIDA-SAYARI A，GARGOURI-BOUZID R，BIDANI A，et al.Overexpression of Δ1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase increases proline production and conferssalt tolerance in transgenic potato plants［J］.Plantscience，2005，169：746-752.

［14］SU J，WU R.Stress-induciblesynthesis of proline in transgenic rice confers fastergrowth understress conditions than that with constitutivesynthesis［J］.Plantscience，2004，166：941-948.

［15］支立峰，陈明清，余涛，等.p5cs转化水稻细胞系的研究［J］.湖北师范学院学报（自然科学版），2005，25（4）：39-43.

［16］VENDRUSCOLO E Cg，SCHUSTER I，PILEGGI M，et al.Stress-inducedsynthesis of proline confers tolerance to waterdeficit in transgenic wheat［J］.Journal of Plant Physiology，2007，164：1367-1376.

［17］李鸿雁，李大红.转拟南芥P5CS1基因增强羽衣甘蓝的耐旱性［J］.植物生理学报，2014，50（7）：1009-1013.

［18］SMITH N，KILPATRICK J B，WHITELAMg C.Superfluous transgene integration in plants［J］.Critical Reviews in Plantsciences，2001，20：215-249.

［19］NOTEBORN H P，LOMMEN A，VANDER JAGT R C，et al.Chemical fingerprinting for the evaluation of unintendedsecondary metabolic changes in transgenic food crops［J］.Journal of Biotechnology，2000，77：103-114.

［20］AUREKH C，KUMARI K N，ARUNA L，et al.Expression of the Vigna aconitifolia P5CSF129Agene in transgenic pigeonpea enhances proline accumulation andsalt tolerance［J］.Plant Cell Tissue and Organ Culture（PCTOC），2014，116（1）：27-36.

［21］CHEN J B，YANG J W，ZHANG Z Y，et al.Two P5CSgenes from common bean exhibitingdifferent tolerance tosaltstress in transgenic Arabidopsis［J］.Journal ofgenetics，2013，92：461-469.

［22］SZÉKELYg，ÁBRAHÁM E，CSÉPL A，et al.Duplicated P5CSgenes of Arabidopsis playdistinct roles instress regulation anddevelopmental control of proline biosynthesis［J］.The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2008，53（1）：11-28.

（责任编辑：程智强）

Effects ofdroughtstress on photosynthetic characteristics of kalegenetically modified by AtP5CS1gene of Arabidopsis

LIda-hong1，LI Wei1，SHAO Hai-kuo2
（1Department of Bioengineering，Huanghuai College；2Landscaping Center，Huanghuai College，Zhumadian 463000，China）

Pot experiments with both kalegenetically modified by AtP5CS1gene of Arabidopsis and wild kale（CK）were carried out，and their leaf variations ingas exchange and chlorophyll content and fluorescence parameters werestudied under waterstress for 0d，2d，4d and 6d and rehydration for 2d and 4d.The resultsshowed that with waterstressduration increasing，thegenetically modified kale’s indicatorssuch as chlorophyll content，net photosynthetic rate（Pn），stomatal conductance（Gs），intercellular CO2concentration（Ci），transpiration rate（Tr），water use efficiency（WUE）and Fv/Fm（maximal efficiency of PSⅡphotochemistry）decreased less than the CK’s，and thegenetically modified kale’sstomatal limitation value（Ls）and nonphotochemical quenching coefficient（NPQ）increased less than the CK’s，indicating that thedamage by waterstress to thegenetically modified kale was less than that to CK；After watering，thegenetically modified kale’s photosynthetic parameters，chlorophyll fluorescence parameters and chlorophyll content recovered rapidly，whereas the CK’s recoveredslowly.Under waterstress thegenetically modified kale could maintaingood photosynthetic characteristics and have agood physiological compensating action after watering，being an important physiological factor for adaptation to arid environments.

Kale；Transgene；Drought resistance；Photosynthetic characteristics；Check experiment

S635.9

A

1000-3924（2016）04-006-05

2015-06-29

李大红（1969—），男，博士，副教授，主要从事园林植物研究工作。E-mail：lidahong27@163.com