钝缀锦蛤胚胎、幼虫及稚贝发育观察

张柯馨,杨尚松,罗泽鑫,张 元,展建强,陈麟广,卢怡凝,刘志刚,2

( 1.广东海洋大学 水产学院,广东 湛江 524088; 2.广东省海产无脊椎动物科技创新中心,广东 湛江 524088 )

钝缀锦蛤(Tapesdorsatus)俗称沙包螺,属帘蛤科缀锦蛤属,是一种热带、亚热带海洋经济贝类,多栖息于潮间带下区和潮下带浅水区的泥沙底中,广泛分布于西太平洋和印度洋水域[1]。钝缀锦蛤具有个体大、生长速度快、肉质鲜美、对污染抵抗能力强等优点,是一种经济价值高的贝类,目前以天然捕捞为主,由于自然资源破坏严重,其人工养殖已提上日程。目前,国内对钝缀锦蛤的研究多集中在生态习性[2]、繁殖生物学及稚贝生长[3]、形态性状对活体质量的影响[4]、摄食率和同化率[5]、遗传力分析[6]、分子分类[7-8]等方面;国外钝缀锦蛤的相关研究集中在孵化生产[9]、盐度试验[10]、生长和存活[11]等方面。在贝类的遗传育种中,掌握其胚胎发育、幼虫生长过程至关重要[12]。而有关钝缀锦蛤的胚胎、幼虫及稚贝发育的形态观察报道较少,仅见巫旗生等[13]关于钝缀锦蛤繁殖周期和胚胎发育的报道,其主要研究了钝缀锦蛤的性腺发育和周年不同阶段肥满度变化,对其胚胎、幼虫发育描述较少。为此,笔者研究了钝缀锦蛤胚胎、幼虫、稚贝连续发育过程的形态特征及发育规律,旨在为钝缀锦蛤的形态发育生物学和人工育苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2020年12月—2021年2月在广东湛江雷州市覃斗镇英岭村贝苗培育基地进行。钝缀锦蛤2龄亲贝,为采集自越南自然海区的野生个体,平均壳长(64.94±3.22) mm、平均壳高(43.65±2.65) mm、平均壳宽(26.32±1.24) mm。

1.2 方法

1.2.1 人工育苗

亲本生殖腺饱满,包围整个内脏团,雌性呈乳白色,雄性呈橙黄色。将成熟亲贝平铺于塑料筐底,置于育苗车间阴干6～8 h,再放置于水温25 ℃的产卵池中,流水刺激催产,密度2～3个/mL,产卵过程保持充气,受精卵发育成D型幼虫后按常规育苗方法培养;当50%的幼体长至壳顶后期,投放30 cm×30 cm黑色塑料板附着基采苗;稚贝壳长达0.8～1.0 mm时,即可作为商品贝苗出池,结束试验观察。培育全程保持微充气,温度25～26 ℃,盐度29～31,pH 7.6～8.0,溶解氧质量浓度>6.5 mg/L。浮游期幼虫采用封闭式培育,不换水,投喂小球藻(Chlorellavulgaris)。附着后1周采用流水式培育,饵料为虾塘复合藻,主要有波吉卵囊藻(Oocystisborgei)、小球藻、扁多甲藻(Peridiniomdepressum)等,经抽水泵自虾塘抽出后过300目筛网后投喂。每日14:00测量幼虫的壳长、壳高与密度。

1.2.2 胚胎、幼虫和稚贝的形态观测

于光学显微镜10×10倍带目微尺刻度镜头下观察胚胎、幼虫、稚贝各时期形态特征,并用游标卡尺(精确度0.02 mm)对随机选取的30个样本进行壳长、壳高的测量。各时期测量的时间点取在50%个体进入该时期为标准。

1.2.3 数据处理

试验数据采用平均值±标准差表示,用Origin软件作图。

生长率计算公式如下:

RL=(Lt-L0)/t

Rh=(ht-h0)/t

式中,RL为壳长生长率(μm/d),Rh为壳高生长率(μm/d),L0和Lt分别为各个发育阶段初始壳长(μm)和此发育阶段结束时壳长(μm),h0和ht分别为各个发育阶段初始壳高(μm)和此发育阶段结束时壳高(μm),t为各个发育阶段的发育时间(d)。

2 结 果

2.1 胚胎发育

在水温 25～26 ℃、盐度 29～31 条件下,钝缀锦蛤胚胎发育速度见表1。钝缀锦蛤卵子呈圆形,未见卵核,不见胚泡,规格为(59.0±2.2) μm。受精后卵子隆起受精膜(图1a),约0.25 h释放第1极体(图1b),约隔10 min释放第2极体。受精后约 0.75 h完成第1次卵裂,形成1大1小2分裂球的2细胞期(图1c)。第2次卵裂在受精后约1.08 h完成,形成1大3小4个分裂球的4细胞期(图1d)。受精后约1.75 h,完成第3次卵裂,形成1大7小8个分裂球的8细胞期(图1e)。约2.38 h完成第4次卵裂,形成1大15小16个分裂球的16细胞期(图1f)。钝缀锦蛤受精卵第1次、第2次卵裂为不等全裂,自第3次卵裂开始为螺旋卵裂。受精后约3.5 h进入32细胞期及以上的桑葚期(图1g),外表似桑葚果。桑葚期胚胎进一步发育,约在受精后4 h,进入椭圆形的囊胚期,囊胚的表面出现纤毛,受精膜破裂,胚胎开始转动(图1h)。受精后约4.5 h,发育形成原肠胚,出现原口(图1i)。受精后6.5 h,胚体逐渐变成柠檬形,随后顶部隆起一圈纤毛环,其上密布纤毛,使胚体快速游动,纤毛环中央有一根纤毛,称为顶纤毛,通过摆动控制胚体游动方向,胚体尾部半透明区为分泌贝壳的壳腺,此期为担轮幼虫期(图1j)。受精后约16 h,担轮幼虫后背方左右各分泌1片半圆形贝壳,2片贝壳中央外凸,在幼虫背部呈直线铰合,在幼虫腹部游离,将虫体包含在其中,担轮幼虫纤毛环延伸和拓宽成为面盘,在壳内外伸缩自如,形成D形幼虫(图1k),至此,胚胎孵化完毕。

图1 钝缀锦蛤胚胎幼虫及稚贝发育结构Fig.1 Development structure diagram of embryos, larvae and juvenile T. dorsatusa.卵子; b.受精卵(出现第1极体); c.2细胞期; d.4细胞期; e.8细胞期; f.16细胞期; g.桑葚期; h.囊胚期; i.原肠期; j.担轮幼虫; k.D形幼虫; l.壳顶初期幼虫; m.壳顶中期幼虫; n.壳顶后期幼虫; o.刚完成附着长出次生壳的稚贝; p.附着后无管期稚贝; q.单管期稚贝; r.双管期稚贝.a.egg; b.fertilized egg(release of the first polar body); c.2-cell stage; d.4-cell stage; e.8-cell stage; f.16-cell stage; g.morula; h.blastula;i.gastrula; j.trochophore; k.D-shaped larva; l.early umbo larva; m.medium term umbo larva; n.post umbo larva; o.juveniles with newly attached and grown into secondary shell; p.non siphon stage juvenile after attachment; q.single siphon stage juvenile; r.double siphon stage juvenile.

表1 钝缀锦蛤胚胎发育时间Tab.1 Embryonic development schedule of T. dorsatus

2.2 幼虫及稚贝发育

2.2.1 各时期划分及对应体尺和发育时间

根据幼虫与稚贝的初始壳长、壳面观、足部的形成与变化、平衡囊与鳃丝的形成、面盘退化时间、足丝的出现时间、水管形成等特征,将钝缀锦蛤浮游幼虫期分为D形幼虫、壳顶初期幼虫、壳顶中期幼虫、壳顶后期幼虫、变态期幼虫等5个时期[14];将稚贝期分为无管期稚贝、单管期稚贝、双管期稚贝3个时期[15]。幼虫和稚贝各时期起始体尺和发育时间见表2。

表2 钝缀锦蛤幼虫和稚贝发育各期起始体尺和发育时间Tab.2 Initial body size and development time of larva and juvenile of T. dorsatus

2.2.2 幼虫发育各期特征

(1)D形幼虫:D形幼虫初始壳长(101.8±3.7) μm,第1天消化系统尚未完善,尚不具备吞食消化的机能。第2天幼虫消化道已打通,开始吞食和消化食物,幼虫胃部开始出现单胞藻颗粒,肝脏颜色逐渐变深。D形幼虫壳长(101.8±3.7)～(153.8±5.3) μm。

(2)壳顶初期幼虫:幼虫壳顶由直线状态微微变成弧形,在内脏团下方形成圆球形的足原基。消化盲囊和胃逐渐发达,对单胞藻消化与吸收能力增强,消化盲囊呈黄褐色或黄绿色(图1l)。此期壳长(153.8±5.3)～(185.7±8.2) μm。

(3)壳顶中期幼虫:背部壳顶继续隆起,似圆滑低矮的小山丘,壳面观壳顶接近左右对称。足原基由圆球形发育为靴状,足基部发育出1对空泡状的细胞团,直径约10 μm,里面含1粒圆形的灰褐色耳石,即平衡囊(图1m)。此期壳长(185.7±8.2)～(213.1±6.9) μm。

(4)壳顶后期幼虫:此时壳顶隆起更显著,壳面观壳顶仍然接近左右对称,靴状足延伸呈带状,有一定的伸缩能力,同时,两对成管状的鳃丝于足基部两侧形成。面盘仍很发达,足基部的平衡囊由于耳石颗粒增大而变得明显,直径约15 μm,幼虫发育过程中未出现“眼点”。幼虫成熟进入附着的特征为鳃丝形成、平衡囊增大,壳长(228.4±11.2) μm(图1n)。此期壳长(213.1±6.9)～(228.4±11.2) μm。

(5)变态期幼虫:D形幼虫经过17 d 发育至变态期幼虫,约3 d后附着完毕。此期面盘萎缩,浮游能力变弱,并逐渐下沉至附着板表面或水池底部,一边依靠尚未脱落的面盘做间歇性浮游,一边利用足部在底部做匍匐运动(此期幼虫也可称匍匐幼虫),随后,面盘上的纤毛细胞逐渐脱落,最终面盘解体消失,失去浮游能力,进入短暂的底栖匍匐生活直至分泌足丝营附着生活,并开始用鳃丝呼吸,靠鳃丝的摆动滤食水中食物颗粒,由浮游向附着生活方式的转变由此完成(图1o)。此期壳长(228.4±11.2)～(234.5±11.2) μm。

2.2.3 稚贝发育各期特征

(1)无管期稚贝:从附着后开始分泌次生壳,胚壳与次生壳衔接处形成边界,即生长线,据此可以判断胚壳的最终大小,两种壳透明度相同。体内鳃丝逐渐增多,呼吸和摄食功能逐步加强。贝壳壳顶在原有基础上逐渐凸起并向前端倾斜,壳面观壳顶开始左右不对称。此期水管尚未形成,排泄和摄食依赖进出水孔完成(图1p)。此期壳长(234.5±11.2)～(484.8±50.8) μm。

(2)单管期稚贝:壳顶继续隆起,向前端倾斜明显,壳面观壳顶左右明显不对称。在壳背后方长出出水管,管口缺乏触手(图1q)。此期壳长(484.8±50.8)～(578.1±76.7) μm。

(3)双管期稚贝:进水管在稚贝壳后腹方长出,其长度短于出水管,管口环绕着触手(图1r),用于阻拦大颗粒物质进入体内。稚贝各器官已发育完善,贝壳形态与成体基本相同。此期壳长大于(578.1±76.7) μm。

2.3 钝缀锦蛤幼虫和稚贝的生长

幼虫期范围是D形幼虫到变态期幼虫,此时期生长较为缓慢,D形幼虫壳长为(101.8±3.7) μm,至变态期幼虫壳长达到(228.4±11.2) μm(图2)。此时期幼虫形态变化明显,直线铰合隆起,体积增大。稚贝期包括附着后无管期稚贝、单管期稚贝和双管期稚贝,稚贝期由于消化系统发育完善,摄食增加,体积迅速增大,附着后无管期稚贝初始壳长为(234.5±11.2) μm,到双管期稚贝时初始壳长达(578.1±76.7) μm,稚贝各器官已发育完善,贝壳形状与成体基本相同。

图2 钝缀锦蛤幼虫、稚贝的生长Fig.2 Growth of larva and juvenile of T. dorsatus

幼虫期的壳长生长率与壳高生长率分别为7.1 μm/d和7.5 μm/d(表3);变态期幼虫至附着无管期稚贝壳长生长率与壳高生长率分别为2.0 μm/d和1.4 μm/d;附着无管期稚贝至单管期稚贝壳长生长率与壳高生长率分别为11.4 μm/d和10.0 μm/d;单管期稚贝至双管期稚贝壳长与生长率壳高生长率分别为18.7 μm/d和18.1 μm/d;双管期稚贝至试验结束壳长生长率与壳高生长率分别为27.1 μm/d和24.6 μm/d;结果与生长曲线中的变化趋势吻合,均呈现“快-慢-快”变化的规律。

表3 钝缀锦蛤幼虫期、稚贝期生长率Tab.3 Growth rate in larva and juvenile stages of T. dorsatus

3 讨 论

3.1 钝缀锦蛤的发育分期及壳长范围界定

钝缀锦蛤的胚胎与幼虫发育分期与大部分双壳贝类相同,如皱肋文蛤(Meretrixlyrata)[16]、厚壳贻贝(Mytiluscoruscus)[17]等;稚贝发育分期则与大部分埋栖性双壳贝类相同,如皱肋文蛤[16]、大獭蛤(Lutrariamaxima)[18]、施氏獭蛤(L.sieboldii)[19]、大竹蛏(Solengrandis)[20]、缢蛏(Sinonovaculaconstricta)[21]、砂海螂(Myaarenaria)[22]等。笔者根据钝缀锦蛤幼虫与稚贝的初始壳长、壳面观、足部的形成与变化、平衡囊与鳃丝的形成、面盘退化时间、足丝的出现时间、水管形成等特征,参照相关资料的划分方法[14-15],更加详细地描述了各期形态特征,并据此将钝缀锦蛤浮游幼虫期分为D形幼虫、壳顶初期幼虫、壳顶中期幼虫、壳顶后期幼虫、变态期幼虫等5个时期,将稚贝期分为无管期稚贝、单管期稚贝、双管期稚贝等3个时期,各期划分的依据与巫旗生等[13]的研究基本一致,但巫旗生等[13]未对稚贝期进行详细的划分。此外,笔者依据幼虫及稚贝各时期形态特征,对幼虫及稚贝各期的壳长范围做了明确的界定,方法是当该批幼虫或稚贝有50%发育到该时期时,即将该批幼虫或稚贝壳长的平均值作为本时期的初始壳长,此期的壳长范围即为本阶段的初始壳长至下阶段的初始壳长。关于钝缀锦蛤的各时期壳长范围的界定未见报道,此研究结果可为钝缀锦蛤形态发育生物学、人工育苗提供参考。

3.2 钝缀锦蛤的受精及胚胎发育特点

钝缀锦蛤雌雄异体,1龄即达性成熟,行体外受精。由性腺成熟的钝缀锦蛤自然排放出卵子,排放过程中卵子进入第1次成熟分裂中期,未见卵核(胚泡),这一时相的卵子即具备受精能力。这与文宇[3]关于钝缀锦蛤的研究结果一致;与张云飞[23]报道的杂色蛤(Ruditapesvariegata)的卵用解剖法取出的不易受精,采用0.01%～0.03%氨海水浸泡10 min可以受精发育的现象吻合,氨海水的作用在于促进卵子在体外发育进入第1次成熟分裂中期。钝缀锦蛤未受精的卵子处于第1次成熟分裂中期,这与菲律宾蛤仔(R.philippinarum)[24]、泥蚶(Tegillarcagranosa)[25]相同。钝缀锦蛤行体外受精,这与大部分双壳贝类相同,如合浦珠母贝(Streptoderatrachelostropha)[26]、栉孔扇贝(Chlamysfarreri)[27]等。钝缀锦蛤卵子受精时会隆起一层受精膜,这与皱肋文蛤[16]、杂色蛤[23]、厚壳贻贝[17]等双壳贝类相同。胚胎发育观察发现,钝缀锦蛤受精卵在受精后15 min即释放第1极体,这与巫旗生等[13]的研究结果相同,同时与相近物种菲律宾蛤仔[24]和波纹巴非蛤(Paphiaundulata)[28]研究结果相一致,比泥蚶[25]和大獭蛤[18]释放慢,但比厚壳贻贝[17]、皱肋文蛤[16]释放快,这种现象除了与品种遗传特征有关,也可能与受精温度高低有关,也不排除与受精时间的界定有关。另外本试验中钝缀锦蛤的卵径及胚胎发育阶段胚胎的大小与巫旗生等[13]报道的相比略小,推测造成差异的原因主要与亲本的品种和规格有关,本试验亲本为采集自越南自然海区的野生个体,而巫旗生等[13]的亲本为采集自广西北部湾自然海区的野生个体,本试验亲本的平均壳长、壳高、壳宽均较广西北部湾野生个体[13]小。在发育速度方面,本试验钝缀锦蛤胚胎期的发育速度与已有报道大致相同,幼虫期的发育速度比已有报道慢,这与其生活的自然生态环境密切相关,也可能与本试验采用的饵料种类及培育方式与已有报道不同有关。

3.3 钝缀锦蛤浮游幼虫发育成熟进入附着阶段的特征

许多双壳贝类浮游幼虫发育成熟的显著的特征是具有眼点或平衡囊,眼点是幼虫鳃原基背部上1对由黑色素聚集起来的球形感觉器官,具有感光作用,具有引导幼虫背光附着的作用;平衡囊是幼虫足基部上的1对呈空泡状的细胞团,中央包含1粒圆球形灰褐色耳石。据报道,许多附着型或固着型双壳贝类幼虫发育过程中都有眼点而没有平衡囊,如栉孔扇贝[27]、长牡蛎(Crassostreagigas)[29]、近江牡蛎(Ostrearivularis)[30]、墨西哥湾扇贝(Argopectenirradiansconcentricus)[31]、海湾扇贝(A.irradians)[32]、翡翠贻贝(Pernaviridis)[33]、马氏珠母贝(Pinctadamartensi)[34]、虾夷扇贝(Mizuhopectenyessoensis)[35]、紫贻贝(M.galloprovincialis)[36]、大连湾牡蛎(C.talienwhanensis)[37]等;而埋栖型的双壳贝类多出现平衡囊而没有眼点,如皱肋文蛤[16]、施氏獭蛤[19]、文蛤(M.meretrix)[38]、青蛤(Cyclinasinensis)[39]、紫石房蛤(Saxidomuspurpuratus)[40]、中国蛤蜊(Mactrachinensis)[41]、大竹蛏[20]、缢蛏[21]、砂海螂[22];但据报道西施舌(Mactraantiquata)[42]既有眼点,也有平衡囊。本试验结果显示,钝缀锦蛤幼虫发育过程中没有眼点出现,只有平衡囊,与其他已报道的底栖贝类[16,38-40]相同,但巫旗生等[13]并未提及平衡囊。经上述对多种双壳贝类的对比可见,成熟期出现眼点的种类主要为固着、附着生活的双壳贝类,而出现平衡囊的种类多为埋栖型的双壳贝类。具有平衡囊的种类,可能与埋栖生活过程的爬行或迁移而需要控制身体平衡有关。眼点的作用在于引导幼虫寻找避光的环境进行固着或附着。但也有报道提出了埋栖型的泥蚶[25]为有眼点种类,而埋栖型的西施舌[42]则两者都有,其机理有待进一步研究。

3.4 钝缀锦蛤发育阶段的生长规律

钝缀锦蛤胚胎发育阶段体积变化不明显。自D形幼虫开始,发育至变态附着期幼虫生长较快;变态附着期幼虫发育较慢,与此期幼虫在重构一些器官,消耗能量较多有关;变态附着后由于幼虫器官发育完善,无管期稚贝发育较快;到单管期稚贝发育较慢,与此时期发育出水管,消耗能量较大有关;到双管期稚贝又有一个缓慢的生长期,也与进水管发育消耗能量有关;进水管发育完成后生长变快。由此可见,钝缀锦蛤发育期呈现“快-慢-快”的生长规律,此规律目前尚未见报道。由幼虫期和稚贝期的生长曲线及壳长生长率和壳高生长率可知,钝缀锦蛤幼虫期生长率低,稚贝期生长率高的规律,这与皱肋文蛤[16]、大獭蛤[18]的生长规律相同。

4 结 论

通过对钝缀锦蛤胚胎、幼虫及稚贝发育阶段进行连续观察,记录了从胚胎到稚贝各个发育阶段的形态特征;通过对幼虫、稚贝各时期的壳长测定,划分了钝缀锦蛤的各时期壳长范围;根据从D形幼虫至双管期稚贝壳长、壳高的变化,绘制出钝缀锦蛤幼虫及稚贝发育期的生长曲线,并得出其发育期呈现“快-慢-快”的生长规律。