贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅生长、消化及免疫的影响

孟文蓉,米浩宇,黄怡忱,黄志发,刘琪彤,夏梦婕,房耀维

( 1.江苏海洋大学 海洋科学与水产学院,江苏 连云港 222005; 2.江苏海洋大学 食品科学与工程学院,江苏 连云港 222005 )

泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)是包括我国在内的亚洲国家的重要淡水养殖品种,其味道鲜美、营养丰富,素有“水中人参”的美誉。近年来,随着规模化养殖的不断推进,使用抗生素导致药物残留等食品安全问题日益突出,严重影响了产业健康发展。目前,禁止抗生素作为动物饲料添加剂应用已逐步成为世界各国的共识,因此寻找及研发安全、无毒、无副作用的抗生素替代品成为泥鳅养殖的必然选择[1]。在若干替代品中,益生菌因其无毒、无抗药性、无残留等优点引发广泛关注。

笔者通过在泥鳅饲料中添加不同水平的贝莱斯芽孢杆菌MSP05,研究其对泥鳅生长性能、肠道消化酶活性及形态、抗氧化能力和非特异性免疫的影响,以期为泥鳅规模化养殖的病害防御和促进生长提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料与条件

试验用贝莱斯芽孢杆菌MSP05、攻毒用嗜水气单胞菌为本实验室从土壤、泥鳅病体中分离所得。泥鳅购自江苏连云港赣榆养殖技术服务中心,室内暂养并禁食24 h后选取初始平均体质量为(3.24±0.14) g 的泥鳅共360尾。

参照Thurlow等[10]的方法,将保存的贝莱斯芽孢杆菌MSP05活化培养,用无菌生理盐水调整至密度为5×109cfu/mL的浓缩制剂。按照0、1×106、1×107和1×108cfu/g的剂量设计,将菌剂用无菌生理盐水按比例稀释后,等量喷洒至基础饲料中,并用3%鱼油均匀包裹,充分搅拌后自然阴干,4种饲料分装,4 ℃保存备用。嗜水气单胞菌经TSB培养基活化培养后,用无菌生理盐水稀释至2.0×107cfu/mL。

1.2 试验设计与管理

360尾泥鳅随机分配到12个聚氯乙烯鱼缸中,设置1个对照组和3个试验组,每组3个平行,每个平行30尾。对照组饲喂仅添加无菌生理盐水和鱼油的饲料,试验组分别饲喂含1×106、1×107、1×108cfu/g贝莱斯芽孢杆菌MSP05的日粮。试验期间水温(26±1) ℃,pH 6.9～7.3,溶解氧质量浓度(6.4±0.4) mg/L,氨氮质量浓度<0.06 mg/L,亚硝态氮质量浓度<0.02 mg/L。日换水30%,日投喂2次(7:00、18:00),投喂量约为其体质量的3%,并根据各水族箱实际情况适量调整,养殖周期为8周。

1.3 样品采集与测定

1.3.1 样品采集与保存

养殖试验结束并禁食24 h后,统计各鱼缸内泥鳅总数并称量质量。每组随机选取15尾泥鳅(每个平行5尾),间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉后,取9尾于尾静脉处采血,每个平行的3尾血样混合后,离心分离血清,-80 ℃冰箱保存,用于血清抗氧化、免疫指标测定;采血后冰上无菌解剖取肠道组织,剔除表面脂肪后装入无酶离心管中,用液氮迅速冷冻后置于-80 ℃保存,用于肠道消化酶测定;剩余每组6尾鱼,冰上解剖并剪取前肠、中肠、后肠,磷酸盐缓冲液清洗干净后固定,每个平行样品混合保存,用于组织学研究。

1.3.2 生长性能测定

成活率(RS,%)、质量增加率(wWGR,%)和特定生长率(RSG,%/d)按下式计算:

RS=nt/no×100%

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中,nt为终末数量(尾),n0为初始数量(尾),mt为终末体质量(g),m0为初始体质量(g),t为试验时间(d)。

1.3.3 消化酶测定

将液氮冷冻保存的肠道样品取出,冰浴匀浆后离心,取上清液用南京建成生物工程研究所试剂盒测定蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性。

1.3.4 肠道形态测定

取出固定后,将肠组织乙醇梯度脱水、二甲苯脱醇、浸蜡包埋、切片、烘干和染色。每组前肠、中肠、后肠分别做3个以上切片,选取绒毛完整走向平直的切片6张,100倍视野观测拍照,使用ProPlus 6.0处理图像,分别测量绒毛高度、绒毛宽度、肌层厚度、肠壁厚度。

1.3.5 抗氧化及非特异性免疫指标测定

血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、溶菌酶活性和丙二醛含量均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。

1.3.6 感染试验

剩余的泥鳅中每组挑选30尾(每个平行10尾)继续饲喂。稳定5 d后,根据攻毒前经预试验确定的半致死量,腹腔注射2.0×107cfu/mL嗜水气单胞菌0.1 mL,对照组泥鳅腹腔注射等量无菌生理盐水。周期为15 d,观察并记录泥鳅的发病和死亡情况。累积死亡率(RCM,%)按下式计算:

RCM=nm/nc×100%

式中,nm为死亡数量(尾),nc为攻毒数量(尾)。

1.4 统计分析

数据采用平均值±标准差表示,对同一时间点不同试验组的数据进行单因素方差分析,应用邓肯多重比较检验各组数据之间的差异性。通过软件SPSS 17.0进行数据统计与分析,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼生长的影响

与对照组相比,试验组贝莱斯芽孢杆菌MSP05显著提高了泥鳅幼鱼的终末体质量、质量增加率和特定生长率(P<0.05),且不同试验组间差异不显著(P>0.05);1×108cfu/g添加组泥鳅幼鱼成活率显著高于对照组(P<0.05),其他各组间差异不显著(P>0.05)(表1)。

表1 饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼生长的影响Tab.1 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on growth of juvenile loach M. anguillicaudatus

2.2 贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼消化酶活性的影响

各组泥鳅幼鱼肠道消化酶活性测定结果见表2。试验组泥鳅幼鱼肠道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均显著高于对照组(P<0.05);随着贝莱斯芽孢杆菌MSP05添加量的增加,蛋白酶、淀粉酶活性先升后降,在1×107cfu/g添加组达到最大值,脂肪酶活性则不断升高,且各组间差异显著(P<0.05)。

表2 饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼消化酶活性的影响Tab.2 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on digestive enzyme activities of juvenile loach M. anguillicaudatus

2.3 贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼肠道形态的影响

贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼肠道形态的影响见图1、图2。试验结果显示:与对照组相比,除中肠绒毛宽度外,贝莱斯芽孢杆菌MSP05显著提升了泥鳅前肠、中肠各形态指标(P<0.05),且1×106cfu/g添加组指标提升效果最显著;贝莱斯芽孢杆菌MSP05对后肠影响则差异较大,相较于对照组,1×106cfu/g添加组4个形态指标均有所降低,1×108cfu/g添加组肌层厚度也表现出抑制效果,相对而言,1×107cfu/g添加组后肠形态提升最显著。

图1 饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼肠道形态的影响Fig.1 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on intestinal morphology of juvenile loach M. anguillicaudatus

图2 饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼肠道形态数据的影响Fig.2 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on intestinal morphology data of juvenile loach M. anguillicaudatusVH.绒毛高度;VW.绒毛宽度;TM.肌层厚度;TW.肠壁厚度;条形图展示的为平均值±标准差(n=3),字母“a,b,c,d”表示邓肯算法的子集,相同字母或未标记字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05).VH.villus heigh; VW.villus width; TM.thicknesses of musculature; TW.thickness of intestinal wall; bars show the mean±SD(n=3); the letters “a, b, c, d” are subsets by Duncan algorithm; treatments with the same letters or absence of letters are not significantly difference (P>0.05), and different letters indicate significant difference(P<0.05).

2.4 贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼血清抗氧化指标和非特异性免疫的影响

贝莱斯芽孢杆菌MSP05显著影响了泥鳅幼鱼各血清抗氧化及非特异性免疫指标(P<0.05)(表3)。随着菌剂添加量的增加,泥鳅幼鱼血清过氧化氢酶活性不断升高,丙二醛含量不断下降,二者在1×108cfu/g添加组分别达到最高值、最低值;超氧化物歧化酶活性先升后降,在1×107cfu/g添加组达到最大值;此外,泥鳅幼鱼血清溶菌酶、碱性磷酸酶活性也不断增加,在1×108cfu/g添加组分别达到最大值,较对照组分别显著提升了180.56%、35.91%。

表3 饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼血清抗氧化和非特异性免疫指标的影响Tab.3 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on serological antioxidant enzyme activities and non-specific immune index of juvenile loach M. anguillicaudatus

2.5 贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼抗病力的影响

饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌MSP05显著降低了嗜水气单胞菌攻毒15 d后泥鳅幼鱼的死亡率(P<0.05),在1×108cfu/g添加组累积死亡率最低(图3)。在濒死或死鱼中观察到典型的气单胞菌感染症状,主要表现为出血性败血症。

图3 饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌MSP05对嗜水气单胞菌攻毒后泥鳅幼鱼死亡率的影响Fig.3 Effects of dietary B. velezensis MSP05 on cumulative mortality rate of juvenile loach M. anguillicaudatus challenged with A. hydrophila

3 讨 论

3.1 贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼生长性能的影响

3.2 贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼消化酶的影响

水产动物消化酶活性与饲料利用率和养殖效益密切相关,而在饲料中添加适量的益生菌可以提高水产动物消化酶活性,进而提升饲料利用率和养殖成效。109cfu/kg枯草芽孢杆菌(B.subtilis)使彭泽鲫(C.auratusvar.pengsenensis)中肠内淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶活性显著增加[15];经过不同处理的短小芽孢杆菌(B.pumilus)使得斜带石斑鱼(E.coioides)肝脏淀粉酶和脂肪酶活性显著增高[16]。贝莱斯芽孢杆菌MSP05显著提升了泥鳅幼鱼肠道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性,且随着菌体添加量的增加,蛋白酶、淀粉酶活性先升后降,这与珍珠龙胆石斑鱼研究结果一致[17]。贝莱斯芽孢杆菌可能通过自身产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶[14,18-19],并刺激鱼体肠道产生多种高活性消化酶,综合促进宿主对不同营养源的吸收利用。

3.3 贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼肠道形态的影响

除消化酶外,肠道形态发育对鱼类生长也起到至关重要的作用。绒毛高度、绒毛宽度、肌层厚度和肠壁厚度等的增加,均能增加肠黏膜的功能性表面积,提高营养物质吸收率,促进鱼类生长。研究表明,芽孢杆菌能有效改善鱼类肠道形态。以尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)为例,Won等[20]研究发现,枯草芽孢杆菌WB60显著提升了幼鱼肠绒毛高度和肌层厚度;短小芽孢杆菌也显著提升了中肠肌层厚度和皱襞高度[21];而解淀粉芽孢杆菌使鱼体肠道整体黏膜厚度显著提高,中肠、后肠绒毛高度也显著增加[22]。本试验中,贝莱斯芽孢杆菌MSP05显著改善了泥鳅前肠、中肠的形态,而较低或较高的菌体添加量却不同程度抑制了后肠形态发育,这可能与泥鳅后肠消化功能弱化、主要用于辅助呼吸有关[23]。

3.4 贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼抗氧化性能的影响

动物细胞在正常生理条件下会产生活性氧,若活性氧产生和去除之间不平衡会导致氧化应激[24],因此机体往往采取多种抗氧化防御机制以减少机体损伤。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和丙二醛是重要的抗氧化指标。益生芽孢杆菌能够作为抗原刺激鱼体分泌抗氧化酶和抗氧化剂,有效清除多余自由基,阻止脂质过氧化,调节机体的自由径向平衡,从而提高抗氧化能力[25-26];若益生菌添加量过大,可能导致超氧化物歧化酶较过氧化氢酶活性先行降低,在凝结芽孢杆菌(B.coagulans)[27]、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)[28]的相关研究中及本试验中均出现了此现象。

3.5 贝莱斯芽孢杆菌MSP05对泥鳅幼鱼非特异性免疫性能的影响

由于温度限制,大多数鱼类特异性免疫系统不够完善,主要依靠非特异性免疫以抵御外源微生物的入侵。溶菌酶和碱性磷酸酶活性可作为评估鱼类非特异性免疫的重要指标。添加贝莱斯芽孢杆菌JW后,鲫碱性磷酸酶活性显著提高,经嗜水气单胞菌感染后存活率也显著提高[13];贝莱斯芽孢杆菌K2可显著上调珍珠龙胆石斑鱼幼鱼溶菌酶基因的表达,哈维氏弧菌攻毒28 d后其存活率也显著提高[9];浸浴贝莱斯芽孢杆菌DY-6后仿刺参的2种酶活性均显著提高[12]。本试验中,贝莱斯芽孢杆菌MSP05使泥鳅幼鱼血清溶菌酶、碱性磷酸酶活性显著提高,且酶活性与菌体添加量正相关;嗜水气单胞菌攻毒后死亡率也有所降低,说明饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌可提高机体免疫力和抗嗜水气单胞菌致病力。

4 结 论

饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌MSP05能够有效促进泥鳅幼鱼生长,提高消化酶、抗氧化酶活性,改善肠道形态,提升非特异性免疫及对嗜水气单胞菌的抗病力,且添加量为1×108cfu/g时,泥鳅幼鱼生长、非特异性免疫和对嗜水气单胞菌抗病力最佳。因此,贝莱斯芽孢杆菌MSP05有应用于泥鳅饲料的潜力。