中华绒螯蟹新品种种质创制的研究进展

邢秀梅,沈铭浩,李 杰,宁先会,张 凯, 尹绍武

( 1.南京师范大学 海洋科学与工程学院,江苏省特色水产育种与绿色高效养殖技术工程研究中心,江苏 南京 210023; 2.南京市高淳区青松水产专业合作社,江苏 南京 211300 )

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis),属节肢动物门甲壳纲十足目方蟹科绒螯蟹属,又名河蟹、大闸蟹[1]。中华绒螯蟹因含有矿物质元素、脂肪酸、氨基酸、核苷酸和胆固醇等多类营养物质而深受长江流域居民喜爱,其肌肉中蛋白质品质高且肌苷酸的含量丰富,雄蟹性腺中更是包含25种脂肪酸[2]。近年来,我国中华绒螯蟹的种业保护措施较薄弱,加上无序引种和苗种盲目放流,导致种质混杂和退化,严重制约了该产业的绿色发展[3-4]。国外水产选育多以种业企业为主体,投入大、效果显著;国内则以科研单位为主,这样会造成产业集中度低、良种化水平和覆盖率均较低、苗种质量不稳定等一系列问题[5]。因此,对种业的投入和育种技术的突破刻不容缓。

2021年中央一号文件指出,“打好种业翻身仗。农业现代化,种子是基础……加强国家作物、畜禽和海洋渔业生物种质资源库建设……有序推进生物育种产业化应用”[6]。目前已成功选育出中华绒螯蟹“长江1号”(GS-01-003-2011)、“光合1号”(GS-01-004-2011)、“长江2号”(GS-01-004-2013)、“江海21号”(GS-02-003-2015)和“诺亚1号”(GS-01-005-2016)共5个新品种,推动了中华绒螯蟹产业健康发展。但随着市场竞争的日益激烈及产业飞速发展,现有品种远不能满足中华绒螯蟹产业发展需求。此外,目前中华绒螯蟹新品种的选育方法为传统的选择育种,难以避免出现遗传漂变、混杂衰退等问题[7]。随着现代分子生物学和遗传学的不断发展,为中华绒螯蟹遗传育种提供了新的途径,将现代分子育种技术与传统育种技术结合,可提高育种效率、完善性状评价体系。此外,中华绒螯蟹高质量基因组和遗传图谱的相继公布,也为其现代分子育种奠定了基础。

1 中华绒螯蟹传统育种方法与现状

1.1 选择育种

选择育种是一种传统有效的新品种培育方法,通过对群体的反复选择淘汰、优中选优,培育出符合选育目标的优良个体[8]。该方法能够分离并固定优良性状,保留有益的变异,提高中华绒螯蟹的经济性状,提纯和复壮其品种[9]。中华绒螯蟹的选育主要有群体选育、配套系选育和家系选育等。群体选育是挑选表现型优良的中华绒螯蟹群体作为基础群,逐代根据生长速度、体型特征、抗逆性等选育指标选种选配[10]。迄今为止,已通过群体选育培育出了4个新品种(中华绒螯蟹“长江1号”、“长江2号”、“光合1号”、“诺亚1号”)。配套系育种是将拥有某种经济性状和遗传特性的品系或选育系进行配组繁育,聚合培育出具有父本和母本优良经济性状的一种育种方法,中华绒螯蟹“江海21号”为国内首例中华绒螯蟹配套系新品种[11]。吴廉等[12]比较了正、反交两个配套组合与亲本群体的遗传多样性后,发现配套系育种可以聚合选育系的优良性状,提高种群遗传多样性及环境适应能力。家系选育是通过建立大规模家系并开展系统性选择的一种育种方法,已广泛应用于多种甲壳类动物遗传育种中[13-14]。2008年江苏省淡水水产研究所成功突破长江水系大规格中华绒螯蟹家系构建,并不断改进技术,于2017年选择长江水系中华绒螯蟹不同群体的大规格亲蟹构建ES-P2017家系,成功定向构建全同胞家系96个,家系构建成功率达96.00%[15-16]。刘伟等[17]通过建立10个长江系中华绒螯蟹家系,进行系统选择育种,经过LSD多重比较得出不同家系生长性能差异显著的结论,为中华绒螯蟹家系选育奠定了理论基础。现阶段中华绒螯蟹选择育种技术体系已经较为成熟,选育效果显著,应用推广成果突出。

1.1.1 群体选择与选育指标

目前选育成功的新品种均采用选择育种方法。中华绒螯蟹“长江1号”是以2000年从国家级江苏高淳固城湖中华绒螯蟹原种场收集1000组体形特征标准、健康无病的长江水系原种中华绒螯蟹作为基础群体,以生长速度和个体规格为选育指标,连续5代群体选育而成的[4]。 中华绒螯蟹“长江2号”是以2003年从荷兰引回的莱茵河水系中华绒螯蟹作为基础群体,将生长速度、个体规格、形态特征作为选育指标,通过连续5代群体选育而成的[4]。中华绒螯蟹“光合1号”是将来自鸭绿江、辽河、海河、黄河4个不同地理群体的辽河水系中华绒螯蟹组建基础群体,以体质量和规格为主要选育指标,以外观形态为辅助选育指标,经过连续5代选育而成的具有成活率高、抗逆性强、生长速度快等标志性状的中华绒螯蟹新品种[18]。中华绒螯蟹“诺亚1号”是以2004年挑选的体型健壮、附肢齐全、活力强、性腺发育良好、背甲淡青色的689只野生亲蟹构建选育基础群体,其中雌蟹365只、雄蟹324只,组建保种核心群体,开展定向对比繁殖培育而成的[19]。中华绒螯蟹“江海21号”是以2004年和2005年从长江干流南京江段采捕的野生中华绒螯蟹、从国家级江苏高淳长江水系中华绒螯蟹原种场和国家级安徽永言中华绒螯蟹原种场收集的保种群体,构建基础群体,以生长速度、步足长和额齿尖为选育指标,连续4代选育而成的[20]。除中华绒螯蟹 “长江2号”[21]外,所有新品种的基础群体均来自长江、辽河水系。中华绒螯蟹“长江2号”通过引种驯化,选育效果胜过“长江1号”,定向改造了中华绒螯蟹的区系组成,提高质量和产量,充实育种材料。并且新品种的选育指标也早已不局限于生长速度和个体规格,开始出现具有高辨识度的形态特征。

1.1.2 选育效果评估

通过选择育种,中华绒螯蟹“长江1号”生长速度快,2龄成蟹生长速度提高16.7%;形态特征明显,背甲宽大于背甲长,呈椭圆形,体型好;规格整齐,雌、雄体质量变异系数均小于10%[22]。中华绒螯蟹“长江2号”生长速度提高约19.4%,平均个体规格增加约18.5%;成蟹养殖群体规格整齐,雌雄体质量变异系数均小于10%,遗传性状稳定[21]。中华绒螯蟹“光合1号”规格大,成活率高;背甲宽度(额宽、第一侧齿宽)较长、背甲厚度(体高)较高,第4步足较短,多态位点比例降低了2.58%,遗传性状稳定[23]。中华绒螯蟹“诺亚1号”体型健壮、附肢齐全、活力强、性腺发育良好;有4个额齿尖,额齿间缺刻深,内额齿间缺刻呈“U”型;生长速度提高19.86%,雄蟹200 g以上比例逾56%,300 g以上比例超过10%;雌蟹150 g以上比例逾42%,200 g以上比例超过12%[19]。中华绒螯蟹“江海21号”生长快、规格大、产量高;步足长、成活率高、遗传稳定等;生长速度提高17.8%以上,雌蟹150 g、雄蟹200 g以上的大规格比例可超过50%[20]。由此可见,新品种选育成效显著,适合应用推广。

1.2 杂交育种

杂交育种一般指不同品系、品种间,甚至种间、属间或亚科间个体的交配[23]。利用杂交优势,能够获得生长速度、抗病性、品质等养殖性状优于双亲的中华绒螯蟹新品种,或使后代获得遗传改良,在品种改良以及生产应用中发挥作用,是一种基础有效的育种途径[24]。目前,研究人员已在中华绒螯蟹杂交育种领域进行了一系列尝试。彭武汉[25]将中华绒螯蟹分别与“珠江毛蟹”(中华绒螯蟹)、日本绒螯蟹(E.japonica)杂交,均能培育出幼蟹,观察发现杂交子代的前缘齿及侧齿存在不同程度的变异。此外唐士桥等[26]将绥芬河水系日本绒螯蟹与辽河水系中华绒螯蟹进行杂交试验,所获得的杂交一代侧缺刻较浅,中缺刻呈V形,后疣突不明显,没有明显的杂种优势,可正常繁育后代。吴旭干等[27-28]将日本绒螯蟹及其杂交子代性腺发育和生化组成以及遗传多样性进行了比较分析,结果表明,绒螯蟹属不同种间是可杂交的。虽然以上研究尚未发现具有明显优良性状的中华绒螯蟹杂交品种,但为绒螯蟹属的种间杂交提供了实践基础,随着对中华绒螯蟹潜在经济性状的挖掘,较为成熟的杂交育种技术能更直接地将性状保留下来。

2 中华绒螯蟹现代育种方法与现状

我国中华绒螯蟹育种方式正将传统的选育方法与现代分子遗传学手段相结合,进行现代育种方式有细胞工程育种、分子标记辅助育种等。

2.1 细胞工程育种

细胞工程育种技术研究目前主要集中在中华绒螯蟹多倍体育种以及性别控制方面。多倍体育种是通过物理、化学以及生物学方法,增加中华绒螯蟹的染色体组至3组及3组以上,改造其遗传基础,从而培育出个体大、生长快、抗病力强、成活率高的优良品种[29]。实现体外培养是多倍体育种的第一步,但中华绒螯蟹的抱卵特性使受精卵离体培养十分困难[30]。李泰煌等[31-32]以“杀蟹取卵”的人工授精法成功实现了中华绒螯蟹受精卵的体外培养;邱高峰等[33-35]已攻克抱卵及体外孵化的难题。体外培养技术的突破为中华绒螯蟹多倍体育种奠定了基础。陈立侨等[36-37]利用细胞松驰素B处理法诱导出三倍体和四倍体中华绒螯蟹,诱导率高达51.61%和57.89%,这是中华绒螯蟹多倍体育种的首次报道,证明了多倍体育种技术应用于中华绒螯蟹的可行性。崔朝霞等[38]改进方法,运用细胞松弛素B、KCl等化学药物处理中华绒螯蟹,获得77.5%的三倍体率和79.8%的四倍体率。但其采用的方法是直接处理含受精卵的母体,未运用体外培养技术。综上可知,目前中华绒螯蟹的多倍体诱导虽有成功的案例,但其成活率低,且因试剂价格高昂,难以大规模推广。细胞工程育种的突破主要围绕诱导技术的开发以及存活率的保证,多倍体在其他水产生物中的优势若能呈现于中华绒螯蟹中,在个体的生长性状或是群体的种质保护上都具有重大意义。

2.2 分子标记辅助育种

分子标记辅助育种是利用与目标性状紧密相关的分子标记,对具有性状优势的等位基因或基因型的个体进行选择育种,将分子生物学、基因组学的研究结果用于品种选育的技术[39-40]。它能在DNA水平上进行选择,并且选择的准确性较高,不受环境影响,大大缩短育种周期。在中华绒螯蟹遗传育种研究中广泛应用的分子标记为微卫星和单核苷酸多态性分子标记。

近年来,微卫星标记由于其多态性好、杂合率高和共显性遗传等特点,被广泛开发和应用于遗传图谱构建[41]、遗传多样性分析[42]和物种鉴定[43]等方面。熊良伟等[44]利用60个微卫星标记对中华绒螯蟹F1群体的双亲及其子代进行多态性检测,并进行了亲子遗传分离类型及连锁关系分析,成功构建了中华绒螯蟹遗传连锁图谱。遗传连锁图谱的构建是开发分子标记的一个重要环节,为中华绒螯蟹的分子标记辅助育种提供服务。吴滟等[45]从30个微卫星标记中成功筛选出与中华绒螯蟹生长性状相关的分子标记,有望应用于辅助选育。

单核苷酸多态性标记为第3代分子标记,在有关中华绒螯蟹单核苷酸多态性位点的研究中,Xiao等[46]从转录组中开发验证了42个单核苷酸多态性位点,给中华绒螯蟹的遗传多样性分析和选择育种方案提供了理论方向;Qiu等[47]通过SLAF-seq技术鉴定到127 677个单核苷酸多态性位点,并且将其中的17 680个单核苷酸多态性位点定位于染色体上,构建了中华绒螯蟹的首张单核苷酸多态性连锁图谱,在研究某一经济性状时可以寻获与其关联或有作用关系的单核苷酸多态性位点,为中华绒螯蟹分子标记辅助育种提供了重要依据。

近年来开发性别标记、构建高密度遗传图谱等已成为中华绒螯蟹性别决定及分化机制研究的手段[48-49]。Cui等[50]利用高密度遗传连锁图谱揭示中华绒螯蟹性别决定机制为ZW/ZZ型。崔朝霞等[51]公开了1种鉴定中华绒螯蟹性别的特异性分子标记,通过对中华绒螯蟹的雌性、雄性基因组重测序数据比对,筛选雌性特异性片段,经过筛选得到2对引物8227-F1&R1和8227-F23&R23。2对引物均可根据电泳条带结果表明雌雄差异,即只有雌性扩增产物能够产生特异性条带,据此成功对中华绒螯蟹进行性别鉴定。陈晓雯等[52]通过中华绒螯蟹雄性特异Etse基因片段标记进行中华绒螯蟹性别鉴定,电泳结果显示,雄性扩增产物有1条特异性条带,雌性扩增产物没有特异性条带,实现了中华绒螯蟹的性别鉴定,用于满足定向生产需求。

3 展望及对策

目前我国通过传统的选择育种培育出了5个中华绒螯蟹新品种,仍需进一步优化肥满度、成活率等选育指标,关注不同行为学特点(如好斗与温和)、营养品质、不同环境适应能力等性状。随着现代育种技术的发展,需要在全基因组选择育种、单性育种和基因编辑育种等方面实现突破和攻关:

(1)开展全基因组选择育种研究。随着中华绒螯蟹全基因组信息的相继破译,快速选择优良基因型的全基因组关联研究将成为其育种的新方向。而近年中华绒螯蟹病害频发,严重影响其产业发展,因此,对中华绒螯蟹抗病相关基因及其功能的研究是防控其重大疾病(白斑病、肝胰腺坏死病、牛奶病、甲壳溃疡病等)的重要基础工作。可以通过构建抗病中华绒螯蟹家系,在全基因组水平上实现抗病分子标记辅助育种,挖掘抗病性状相关联的分子标记,从而选育出抗病中华绒螯蟹新品种。

(2)加强性别控制和单性育种研究。进一步研究中华绒螯蟹性别遗传特性和性别决定机制,探索其单性(全雌和全雄)育种的路径和可行性,为后续中华绒螯蟹单性育种打下基础。

(3)建立中华绒螯蟹基因编辑技术平台用于育种。CRISPR/Cas9基因编辑技术是未来中华绒螯蟹育种的方向。将基因编辑应用于实际育种还有许多难点需要攻克,如从蟹类中找到有效递送基因编辑原件Cas9和sgRNA的方法、寻找调控优良性状或高抗逆性具有遗传效应的基因等。鉴于部分水生甲壳动物[如脊尾白虾(Exopalaemoncarinicavda)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)等][53-55]基因编辑技术的初步成功,对今后建立中华绒螯蟹基因编辑技术平台提供了参考,为提高育种效率、优化种质,最终实现中华绒螯蟹的基因编辑育种提供了方向。

目前制约中华绒螯蟹遗传育种的关键技术是育种材料的保存与评估技术。今后,应加快建立中华绒螯蟹种质资源库,增设中华绒螯蟹原种场,采取活体保种与DNA样本保存相结合的方式,充实育种材料;针对不同性状的评价方法,建立一套精准的适合中华绒螯蟹表型测定方法,贯穿从育种材料选择和保存、亲本选配到新品种育成整个过程。