硬骨鱼类性别分化过程的表观遗传机制研究进展

姜洁明,刘 鹰,3,刘 奇,闫红伟

( 1.大连海洋大学,辽宁 大连 116023; 2.设施渔业教育部重点实验室,辽宁 大连 116023; 3.青岛海洋科学与技术试点国家实验室,山东 青岛 266237 )

大多数脊椎动物在形态和生理上表现出显著的雌雄两性性别差异,长期以来,性别一直是生命科学研究的重大命题之一[1]。性别决定和性别分化相互联系又有所区别,性别决定是确定性别分化方向的方式,性别分化为具有双向潜力的未分化性腺经过程序性发生的一系列事件,发育成精巢或卵巢,并出现第二性征的过程[2]。大部分鱼类的生长具有显著的性别差异,如黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[3]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[4]、乌鳢(Channaargus)[5]等的雄性个体大于雌性,鲤(Cyprinuscarpio)[6]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]、大西洋鲑(Salmosalar)[8]、欧洲舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax)[9]和半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)[10]等雌性成鱼个体大于雄性。此外,鲟鱼卵可以做鱼子酱,雌鱼的经济价值远高于雄鱼,而河鲀的精巢在我国称之为“西施乳”,雄鱼价格高于雌鱼,因此,在生产上实现单性育种可以极大提高经济效益[11]。与其他脊椎动物相比,鱼类分布广、种类多,同时也拥有最为多样的性别决定方式。因为鱼类的分类处于承上启下的地位,其性别决定除了受到遗传因素的影响外,还容易受到外界环境的影响,如温度、pH、密度、光照强度、溶解氧含量等,并具有高度的可塑性[12-14]。

核酸是遗传的分子基础,它的碱基序列上包含生物体所有的遗传信息,几乎所有的生命活动均由基因调控[15]。1942年,Waddington在研究细胞发育命运时,首次提出了表观遗传学的概念[16],经过30年的沉寂后,在20世纪70年代再次进入人们的视野,并于20世纪80年代后期被重新提出,20世纪90年代末至今迅猛发展,成为生命科学领域中的研究热点之一[16]。表观遗传学主要研究在基因核苷酸序列不发生改变的情况下,DNA及有关蛋白分子发生的可遗传修饰,这些修饰可被细胞“记忆”并在随后的细胞分裂过程中保留下来[17]。目前表观遗传调控机制研究内容主要包括DNA甲基化、非编码RNA调控及组蛋白修饰等。研究人员发现,表观遗传修饰在鱼类的性别分化过程中具有重要的作用,开展与鱼类性别分化过程相关的表观遗传学研究,对深入了解其性别形成机制具有重要意义。因此,笔者重点从DNA甲基化和非编码RNA等方面,综述鱼类性别形成的表观遗传调控机制,为进一步深入研究鱼类性别分化过程中的表观遗传调控机制提供理论参考。

1 DNA甲基化在鱼类性别决定和分化过程中的调控机制

在脊椎动物中DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶的催化作用下,将S-腺苷-L-甲硫氨酸中的甲基转移到胞嘧啶环第5位碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶[18-20]。DNA甲基化通常与基因沉默有关,正常的甲基化水平是调控生物体基因表达的重要方式之一,参与较多生理过程,如维持染色体结构、胚胎发育、细胞分化等,而异常的甲基化水平则会引发疾病。DNA甲基化主要由DNA甲基转移酶dnmt1、dnmt3a、dnmt3b和dnmt3l催化[21]。其中,DNA复制后,dnmt1是DNA甲基化最主要的酶,负责将半甲基化位点恢复到完全甲基化及维持甲基化,Dnmt3a和dnmt3b主要参与新位点甲基化的形成过程。Dnmt3l主要是负责调节其他甲基转移酶的活性,而其本身不具有DNA甲基转移酶活性[22]。复制后的DNA修饰主要发生在DNA序列中的胞嘧啶上(CPG二核苷酸),这些二核苷酸可以聚集在被称为CPG岛的DNA小片段中,CPG岛中存在于许多重要的基因启动子区。DNA甲基化过程会影响其基因的结构,从而进一步影响RNA转录,引起基因沉默。DNA的去甲基化会诱导基因重新表达,去甲基化过程也同样重要,去甲基化包括主动去甲基化和被动去甲基化两个主要过程:主动去甲基化是DNA去甲基酶参与过程下形成的去甲基化,被动去甲基化是DNA甲基化维持机制受到影响[15]。

鱼类性别具有很强的可塑性,很容易受到环境因素的影响。已有研究表明,环境可能会影响鱼类性腺中的DNA甲基化水平,进而调控一些性别分化相关基因的表达,从而影响性别分化的过程,这说明DNA甲基化可能与鱼类的性别分化存在密切的关系[15]。欧洲舌齿鲈具有XX/XY性别决定系统,Pavlidis等[13]研究发现,在欧洲舌齿鲈性别分化之前,温度能影响其性别分化,当水温较高(20 ℃)时,幼鱼性腺大部分发育为精巢,而水温较低(13 ℃)时,幼鱼性腺大部分发育为卵巢。雌激素是通过细胞色素P450芳香化酶将雄激素进行转化而产生的,该酶主要由细胞色素P450第19家族-A亚家族-多肽1a(cyp19a1a)编码[23-24]。在分子性别分化关键期的雌鱼性腺中,芳香化酶和内源性雌激素特异表达和合成,诱导卵巢分化[25-26]。研究还发现,雌鱼体内雌激素水平下降能够诱导雌鱼的雄性化,而雄鱼体内雌激素水平上升能够诱导其雌性化[27-33]。Navarro-Martín等[34]对欧洲舌齿鲈幼鱼研究发现,在性腺形成前温度对性别分化影响最大,雄性性腺中cyp19a1a启动子的DNA甲基化水平是雌性性腺中的两倍,并且较高温(21 ℃)会诱导雌性幼鱼cyp19a1a启动子甲基化水平升高,诱导的cyp19a1a启动子高甲基化可能阻止了cyp19a1a的转录激活,从而减少了芳香化酶表达水平及雌激素的产生,最后诱导未分化的幼鱼向雄性分化,说明温度可能会通过DNA甲基化影响欧洲舌齿鲈性腺中性别分化相关基因调控进而调控其性别分化[35]。

半滑舌鳎具有ZW/ZZ性别决定系统,其中Z连锁doublesex和mab-3相关转录因子1(dmrt1)基因的雄性特异性表达与其精巢分化相关[36]。Cui等[37]使用TALEN技术敲降半滑舌鳎幼鱼性腺中的dmrt1基因,结果表明,基因型为雄性的幼鱼在1龄时性腺发育成卵巢,说明dmrt1基因在半滑舌鳎的性别分化过程中起着十分重要的作用。在常温条件下(22 ℃),约14%的ZW半滑舌鳎遗传雌性被逆转为表型雄性(伪雄性),在性别发育关键时期将半滑舌鳎幼鱼暴露在更高的温度(28 ℃)下会使性逆转率增加至73%[38]。Shao等[39]进一步研究发现,半滑舌鳎在约22 ℃进行养殖,性逆转的伪雄鱼具有繁殖能力,其后代ZW-F1的逆转率(94%)极高,这表明性逆转的能力是可遗传的;同时对半滑舌鳎使用全基因组重亚硫酸盐测序进行性腺中整个基因组的DNA甲基化模式分析,结果显示,雄鱼和伪雄鱼性腺中dmrt1的甲基化水平均较低,而在雌性中为高水平甲基化,表明雄鱼和伪雄鱼不仅在性腺组织学上结构相同,而且dmrt1基因的DNA甲基化水平也是相同的。

Wen等[40]检测了牙鲆成鱼中cyp19a1a和dmrt1基因的表达部位、表达水平和甲基化模式,结果表明,dmrt1基因在精巢中的表达量是卵巢中的约70倍,而cyp19a1a基因在卵巢中的表达量是精巢中的约40倍。Dmrt1启动子CpGs在精巢中未发生甲基化,但在卵巢中甲基化接近60%;相反,精巢中的cyp19a1a启动子甲基化接近100%,而卵巢中的cyp19a1a启动子甲基化则约为75%。Si等[41]发现,在牙鲆卵巢分化过程中,cyp19a1a与其转录激活因子foxl2甲基化和基因表达水平密切相关,这两个基因表现出相似的表达模式。这些研究结果表明,dmrt1、cyp19a1a和foxl2基因的甲基化水平对牙鲆的性别分化具有重要作用。Zhou等[42]研究了低温诱导红鳍东方鲀(Takifugurubripes)雄性化过程中性腺DNA甲基化水平的变化规律,对雄性、雌性和低温处理产生伪雄性的红鳍东方鲀性腺进行了全基因组甲基化测序和分析,结果显示雄性、雌性和伪雄性性腺基因组中胞嘧啶(C)残基的甲基化水平分别为11.016%、10.428%和11.083%。经BSP克隆测序法验证,amhr2基因在正常雄性和伪雄性中呈低甲基化水平,在正常雌性中呈高甲基化水平,而cyp19a基因在正常雌性呈低甲基化水平,在雄性和伪雄性中呈高甲基化水平。

在雌雄同体鱼也发现类似现象,黄鳝(Monopterusalbus)从胚胎期到初次性成熟,其性腺都是卵巢,能产生成熟的卵子,但首次产卵后的卵巢逐渐转变为间性性腺,然后转化成精巢,开始产生精子。研究发现,在其间性性腺中,cyp19a1a启动子的甲基化水平高于其在卵巢中的水平,且在雌性→间性→雄性性腺转变过程中,性腺中cyp19a1a启动子的甲基化水平也在不断升高[43]。用dnmt抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-dc)处理可以逆转黄鳝的自然性别变化,表明DNA甲基化可能抑制黄鳝性腺中cyp19a1a基因的表达,进而控制黄鳝的性逆转。黑鲷(Acanthopagrusschlegelii)在幼鱼期全部发育为雄性,在2龄后有一半的鱼会性逆转为雌性,在发生性逆转时,精巢中的cyp19a1a启动子的甲基化水平下降,cyp19a1a基因的表达水平上升[44]。对黑鲷幼鱼使用外源雌激素(E2)处理2龄下的雄性幼鱼,会诱导雄性幼鱼提前进行性逆转,停止使用E2后雌性幼鱼又变回雄性,但是处理过程中性腺cyp19a1a启动子的甲基化水平没有下降,cyp19a1a基因的表达水平和内源性雌激素水平也没有上升[44]。将2龄黑鲷精巢切除后1个月,发现性腺中cyp19a1a启动子的甲基化水平明显降低,而且其性别也发生了改变,说明某些来源于精巢的因素可能影响cyp19a1a启动子的甲基化水平。这些结果表明,cyp19a1a基因表达的表观遗传调控也可能在雌雄同体鱼的自然性别变化及性逆转中起着重要作用[45]。因此可以发现,DNA甲基化既参与雌雄异体鱼的性别分化和性别逆转,也参与雌雄同体鱼的性别分化和性别逆转,DNA甲基化作为一种相对稳定的表观遗传修饰,可能动态地调节基因表达,进而调控鱼类性别分化。

2 非编码RNA在鱼类性别决定和分化过程中的调控机制

非编码RNA(ncRNA),包括miRNA、siRNA、piRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、circRNA等,是一类被转录但未被翻译成蛋白质的RNA分子,与一些最复杂的表观遗传学现象有关。

2.1 小分子RNA

非编码RNA中研究最广泛的是小分子RNA(miRNA),它是一类由内源基因编码的长度18～24个碱基的非编码单链RNA分子,广泛存在于真核生物当中,并且在物种间高度保守[46]。成熟的miRNA通过结合到mRNA上3′非翻译区(3′ UTR)或者蛋白质编码区(CDS)的靶位点序列从而抑制其表达,影响生命过程中一系列的重要进程[47]。

自1993年Lee等[48-49]第一次从线虫中发现miRNA以来,已经在超过250个其他物种中发现了miRNA的存在,迄今为止,在人类中已经发现了超过2500个miRNA。miRNA已被证明在脊椎动物的性别分化、配子发生和有性繁殖中发挥重要作用。在小鼠性别决定的关键时刻,已经发现miR-124能够阻止sox9在卵巢细胞中的表达,这是第一个证据表明miRNA参与了性别决定和性腺发育的过程[50]。在鸡中,雄性高表达的miR-107通过直接靶向cyp19a1a基因的表达来介导雌激素信号的转录后调节[51]。Peng等[52]通过对橘小实蝇胚胎性别决定关键时期进行小RNA测序及生物信息学分析筛选,获得了靶向橘小实蝇tra(Bdtra)基因的miRNA-1-3p,通过双荧光素酶试验证明,miR-1-3p能直接作用于Bdtra,抑制其表达。随后通过胚胎注射miR-1-3p类似物和抑制剂、RNAi、CRISPR/Cas9基因编辑系统等方法进一步证实,miR-1-3p通过转录后抑制Bdtra基因的表达,促进启动下游Bddsx基因的雄性选择性剪切,促进雄性性别分化,在橘小实蝇的雌雄分化中发挥了关键作用。该研究首次揭示了miR-1-3p参与调控橘小实蝇性别决定的机制。这些结果为性别决定机制研究提供重要依据和新见解,对阐述生物性别分化具有重要的科学意义。

Let-7是首个在硬骨鱼中发现的miRNA,其在多种动物中均有表达,具有高度的保守性[53],李文笙等[54]已综述过近年来一些鱼类雌雄性腺中差异表达的miRNA,但是对于硬骨鱼类来说,幼鱼的性腺较小,分离较困难,目前的研究也主要集中在成鱼阶段(即分化后的卵巢和精巢,表1)。Bizuayehu等[55]在大西洋庸鲽(Hippoglossushorglossus)的精巢和卵巢中筛选并鉴定了大量性别差异表达的miRNA,他们发现let-7a、miR143、miR-145和miR-202-3p在成鱼精巢中的表达高于卵巢,miR-202-5p在雄性幼鱼性腺中的表达显著高于雌性幼鱼。Lau等[56]对青鳉(Oryziaslaitpes)的研究发现,miR-202-5p、miR-21、miR-26b在卵巢和精巢中丰度较高,miR-27a、miR-1692、miR143、miR-216b在卵巢中高表达,miR-2184和miR-2476在精巢中高表达。Xiao等[57]对发育过程中(受精后30 d)的尼罗罗非鱼卵巢和精巢进行了测序,发现miR-29、miR-129-3p和miR-727-3p在卵巢中显著高表达,而miR-143、miR-33a和miR-135b在精巢中高表达,其中miR-143的高表达和哺乳动物类似,都与精巢的成熟有关。Wang等[58]报道,miR-101a和miR-155-p在黄河鲤的卵巢中高表达,而miR-203和miR-203b-3p在卵巢发育阶段表达逐渐降低,表明miR-101a和miR-155-p可能在雌性性腺生长和发育中起着重要作用,而miR-203和miR-203b-3p在卵巢发育早期起作用。

Tao等[59]在尼罗罗非鱼性别分化关键期(孵化后5 d)性腺中鉴定出635个成熟miRNAs,其中,XX和XY性腺中显著高表达的miRNAs分别为62和49个,对这些性别差异表达的miRNAs(如miR-9、miR-21、miR-30a、miR-96、miR-200b、miR-212和miR-7977)进行靶基因预测,结果显示,其靶基因包括编码类固醇合成途径关键酶的基因(cyp11a1、hsd3b、cyp19a1a、Hsd11b)和参与脊椎动物性别分化的关键分子(foxl2、amh、star1、sf1、dmrt1),其中cyp19a1a、foxl2和dmrt1已被证实参与尼罗罗非鱼的雌性或雄性性别分化,说明miRNA可能通过靶向这些性别分化相关基因进而调控鱼类性别。笔者还发现一些miRNA(例如miR-96和miR-737)同时调节多个参与类固醇合成的基因,表明在尼罗罗非鱼的性别分化早期可能存在一个复杂的miRNA调控网络。Wang等[60-61]以受精后67 d的尼罗罗非鱼为研究对象进行miRNA鉴定,发现miR-17-5p和miR-20a在卵巢中的表达量显著高于精巢,对它们的靶基因进行预测后发现,其靶基因为dmrt1,qPCR验证结果显示,dmrt1基因精巢中的表达量显著低于卵巢,因此,其认为miR-17-5p和miR-20a可能通过抑制dmrt1基因的表达和促进cyp19a1a基因的表达从而在雌激素生成中发挥作用,其还发现miR-138、miR-200a和miR-338可能负调控cyp17a2基因的表达,而该基因在细胞增殖和精子发生中起到重要作用。综上所述,在尼罗罗非鱼性腺不同发育阶段高表达的miRNA具有差异性,而这些差异表达的miRNA靶向性别分化相关基因,表明在鱼类性别分化关键期miRNA确实发挥重要作用。Yu等[62]预测了点带石斑鱼(Epinepheluscoioides)中miR-26a-5p的靶基因,并通过体内外研究验证其靶向cyp19a1a并抑制其表达,他们同时对点带石斑鱼使用雌激素E2处理,结果显示,处理后雄鱼会发生向雌性逆转,进行qPCR检测发现雌激素E2处理抑制了miR-26a-5p的表达,进而促进cyp19a1a基因的表达,说明miR-26a-5p参与了点带石斑鱼的性别逆转。Yan等[63]发现在红鳍东方鲀性腺未分化幼鱼中鉴定出8个差异表达的miRNA,其中miRNA-novel_167靶向dmrt1基因,fru-miR-15b靶向foxl2基因。近年来关于miRNA在硬骨鱼类性腺发育中的研究还集中在筛选和鉴定性腺发育相关的miRNA,虽然某些性别分化相关靶基因已被确定,但对其功能研究相对较少,应更多地进行鱼类性腺中miRNA的功能研究,以便更早了解并阐明miRNA在鱼类性别分化过程中的调控机制。

2.2 长链非编码RNA

长链非编码RNA(lncRNAs)长度为200～10 000 nt,是一类由RNA聚合酶Ⅱ转录生成的副产物,最开始lncRNA被认为不具有生物学功能,只是基因转录时生成的无作用的产物,直到Brown等[76]研究发现,lncRNA Xist参与哺乳动物X染色体失活的调控,开启了人们对lncRNA的研究历程。随着高通量测序技术的快速发展和广泛应用,人们对分子生物学的研究也越来越深入,大量的lncRNA被发现和挖掘[77-78]。在哺乳动物中,lncRNA已经被证明在性别分化中起着重要作用[79-81],Zhang等[82]对孵化后30 d的中华鳖(Pelodiscussinensis)进行全转录分析,筛选出大量与性别相关的lncRNA。其中,从卵巢中获得932个高表达的lncRNA,从精巢中获得449个高表达的lncRNA,多数参与了性腺分化过程。

在鱼类中lncRNA的研究停留在筛选及鉴定上,如:彭锟等[83]通过转录组测序获得了尼罗罗非鱼雌、雄性腺中呈现差异表达的lncRNA,并发现lncRNA TCONS_02477925在罗非鱼卵母细胞发育和性别分化中可能有重要作用;Yan等[63]对红鳍东方鲀幼鱼性别分化关键时期的性腺lncRNA进行qPCR验证,发现与雌性性腺相比,雄性性腺中79个lncRNA上调,51个下调;Cai[84]使用米非司酮(RU486)诱导XX尼罗罗非鱼的性逆转,并利用RNA-Seq技术对性别偏向的性腺lncRNA表达谱进行了比较研究,发现了大量与性别分化相关的lncRNA,qPCR和原位杂交试验表明,在RU486处理过程中表现出较大差异的lncRNA在早期性别分化过程中表现出明显性别二态性。这些发现为深入研究lncRNA在性别分化中的作用提供了理论基础,lncRNA的表达变化可能是通过表观遗传修饰导致性逆转的部分原因[80]。而lncRNA是如何发挥作用和调控基因表达的,还需进一步研究。

2.3 环状RNA

环状RNA(circRNA)是一种新型的非编码RNA分子,与传统的线性RNA(含5′和3′末端)不同,circRNA分子呈封闭环状结构,长度为几百至几千个核苷酸,不受RNA外切酶影响,表达更稳定,不易降解。circRNA由特殊的前体mRNA可变剪接产生,剪接形式具有多样性,其形成方式可归结为两大类:外显子环化和内含子环化。circRNA有miRNA海绵的作用,其具有miRNA作用位点,可以竞争性地与miRNA结合,从而间接调控miRNA靶基因的表达。Shen等[85]已在斑马鱼中检测出了3000余种circRNA,但是circRNA是否参与到鱼类性别决定和分化当中还有待于进一步研究。

综上所述,非编码RNA确实影响鱼类的性别分化,这些结果为进一步研究非编码RNA对鱼类性别分化影响提供参考。但是目前对非编码RNA的研究不深,大多停留在筛选及鉴定层面,对于非编码RNA的功能研究还有待进一步开展。

3 组蛋白修饰

在真核生物中,核小体是组成染色质的重要成分,由DNA包裹的组蛋白八聚体[两分子的二聚体(H2A-H2B二聚体)和两分子的H3、H4]组成[86]。常见的组蛋白修饰类型有组蛋白甲基化/去甲基化、泛素化/去泛素化、乙酰化/去乙酰化和磷酸化。这些修饰是由一系列酶完成的,包括组蛋白甲基转移酶(HMT)、乙酰转移酶(HAT)、磷酸激酶和泛素化酶。这些翻译后修饰在调节基因表达、染色质动态、DNA修复和基因组稳定性方面发挥着重要作用[87]。

虽然组蛋白修饰在哺乳动物、爬行动物等相关研究较多,但目前尚不清楚其是否参与了鱼类性别决定和分化过程及其机制,仅在近几年中少数鱼类中有报道。高温处理欧洲舌齿鲈幼鱼后,在幼鱼雌性性腺中上调了几种表观遗传调控因子,其中包括:1种作为转录抑制物的DNA结合蛋白jarid2a和1种环指基序pcgf2,它形成蛋白质-蛋白质相互作用以维持转录抑制;也包括1种与组蛋白修饰相关的酶hdac11[88]。Lai等[89]采用液相色谱-串联质谱法分析了黄鳝性逆转过程中的组蛋白修饰,结果显示,K120处的H2B单泛素化是在精巢当中富集的组蛋白修饰位点,它与精子发生相关,并且在雄性性别决定基因dmrt1修饰中存在大量的修饰位点,特别是在其外显子区域,表明这种修饰可能在精巢dmrt1的转录调控密切相关。综上所述,这些数据为鱼类性别分化的表观遗传学研究提供了新的资源。

4 展望与挑战

鱼类性别决定和分化是一个极其复杂的生物学过程,鱼类的性别具有较高的可塑性,除了受到遗传因素影响,还会受到温度、光照、pH等环境因素影响。外界环境因素会诱导表观遗传修饰的改变进而调控性别分化的过程。因此研究硬骨鱼性别决定和分化过程中的表观遗传机制是非常重要的,不仅能够深入解析鱼类性别分化过程对环境的应答过程,更能使我们全面了解鱼类性别决定与分化的分子调控网络。然而,相关的研究仅在一些主要的经济鱼类和模式动物中开展,未来还需要在其他更多鱼类中开展相关研究。同时,相关研究还有待深入,如:表观遗传信息在世代之间传递的规律如何?已经筛选的性别差异表达的非编码RNA具体功能如何?尚需借助各种分子生物学技术进行深入研究。最重要的是,如何对经典遗传学和新兴的表观遗传学理论知识进行整合分析,全面揭示鱼类性别形成的分子调控网络,并基于此实现鱼类的性别调控育种,是今后水产科技工作者面临的巨大挑战。