姜黄素对大口黑鲈生长性能和非特异性免疫的影响

张美彦,杨 星,姜再胜,赵 凤,李松艳,刘婷婷,张芷欣,商宝娣

( 1.贵州省农业科学院 水产研究所,贵州 贵阳 550025; 2.贵州省特种水产工程技术中心,贵州 贵阳 550025; 3.安徽省宣城市宣州区农业农村局水产技术推广站,安徽 宣城 242000; 4.贵州师范学院,贵州 贵阳 550018 )

随着水产养殖业不断发展,集约化程度不断提高,养殖规模不断扩大,环境污染加剧,水产养殖病害时常发生,病种不断增多,抗生素的滥用导致养殖水体恶化,细菌产生耐药性[1],对生态环境和食物链的健康产生不利影响。虽然接种疫苗可以预防疾病的发生,但养殖对象个体量极大、接种程序复杂、病原体特异性差异较大、成本高等因素,限制了疫苗在水产养殖中的应用[2]。由于抗生素的禁用与疫苗的局限性,亟需一种安全、能防病且成本较低的中草药类来保障水产养殖对象的健康。姜黄素是一种极具生理活性的物质,主要从植物莪术、姜黄、郁金等中提取。姜黄素包含了2个邻甲基化的酚以及1个β-二酮功能基团,这种结构特性与其多种生物活性作用都高度相关[3],具有抗氧化、抗炎、消除自由基、增强免疫、促进消化等作用[4-5]。姜黄素在水产养殖中的研究相对较少,已有的研究也表明,姜黄素能促进尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)等的生长,提高其消化酶活性,促进鱼体免疫调节等[6]。

大口黑鲈(Micropterussalmoides),又称加州鲈,属鲈形目鲈亚目太阳鱼科黑鲈属,具有生长快、肉质鲜美、经济效益高等特点,是我国水产养殖主要品种之一[7-8]。近几年,随着大口黑鲈养殖集约化程度的提高,传染性疾病暴发的情况频发[9],尤其在鱼苗养殖阶段更易受到多种因素影响,造成鱼体发病和死亡,影响养殖的经济效益。

笔者以大口黑鲈为研究对象,在饲料中添加不同含量的姜黄素,通过对大口黑鲈生长和非特异性免疫及相关抗氧化指标的影响,综合评定姜黄素对大口黑鲈的作用,旨在探明姜黄素对大口黑鲈生长及免疫机能的影响,并为开发大口黑鲈健康养殖的免疫增强剂提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 饲料配方

采用单因子试验设计,在饲料中添加不同水平的姜黄素,共配制出6组基础饲料。姜黄素购自河南中大生物工程有限公司,纯度>98%。1～6号基础日粮(表1)中姜黄素的添加量为0(对照组)、15、30、60、120 mg/kg和240 mg/kg。各种原料粉碎后过80目筛网,制作普通硬颗粒饲料(粒径1.5 mm),自然风干,保存于-20 ℃冰箱待用。

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) %Tab.1 Formulation and proximate composition of the basal diet (air-dry basis)

1.2 试验用鱼及养殖管理

大口黑鲈苗种来自贵州省水产研究所试验基地。选择540尾体表无伤痕、规格一致,平均体质量(4.17±0.39) g的健康苗种,于18个直径720 mm×高600 mm的室内可控温循环水圆形水族桶中进行饲养,每桶30尾,每组3个平行,日投喂3次(8:20—9:00、11:30—12:10和16:50—17:30),日投饵量约为鱼体质量的4%,每日排污清洗水族桶1次。循环水系统日夜连续循环并充气增氧,饲养期间pH 7.0～7.9、温度(18±1) ℃、总氮<0.05 mg/L、溶解氧>5 mg/L、盐度<0.05、硫化氢<0.01 mg/L。60 d养殖试验过程中应保持环境安静,尽量减小环境应激。

1.3 样品采集与处理

养殖试验开始前,测定每组大口黑鲈平均体质量;试验结束后,禁食24 h,将试验鱼放入间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(200 mg/L)麻醉剂溶液中,70 s后捞出,置于湿毛巾上。每个桶取3尾鱼,心脏取血(剪开肌肉,找到心脏下方三角形的膜状区域,从中间向左下方扎针,取血)。每3尾鱼的血液作为一个独立的样本,其中取50 μL血液用于呼吸爆发活性测定,20 μL血液用于血细胞计数,剩余部分血液置于EDTA抗凝管中以4 ℃、2000 r/min(离心半径20 cm)离心30 min制备血清,用于检测生化指标,-80 ℃冻存备用。测量鱼体体质量和体长,解剖,并取内脏和肝脏分别称量质量,将肝脏组织存于-80 ℃冰箱备用。

1.4 指标测定方法

1.4.1 生长指标

养殖试验开始前,测定每组大口黑鲈平均体质量;试验结束后,测定大口黑鲈饲料系数(RFC)、质量增加率(wWGR,%)、特定生长率(RSG,%/d)、成活率(RS,%)、肝体指数(wHSI,%)和脏体指数(wVSI,%),按下式计算:

RFC=mF/(mt-m0)

(1)

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

(2)

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

(3)

RS=nf/ni×100%

(4)

wHSI=mh/mb×100%

(5)

wVSI=mv/mb×100%

(6)

式中,m0为鱼初始体质量(g),mt为鱼终末体质量(g),mF为饲料摄入量(g),t为饲喂时间(d),ni为初始鱼数量(尾),nf为终末鱼数量(尾),mb为样品鱼体质量(g),mh为样品鱼肝脏质量(g),mv为样品鱼内脏质量(g)。

1.4.2 血液常规参数

血红蛋白浓度、红细胞和白细胞密度利用深圳迈瑞全自动五分类动物血液细胞分析仪(BC-5300 VEt)进行测定。试剂盒购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.4.3 血液生化指标

总蛋白采用比色法,白蛋白采用溴甲酚绿法,乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性采用国际临床化学联合会制定的分析测定参考方法(IFCC),由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供试剂盒,在迈瑞BS-400全自动生化分析仪上测定。

1.4.4 血细胞呼吸爆发活性

血细胞呼吸爆发活性的测定参照文献[6]的方法,略加修改进行测定。取抗凝全血50 μL,加入2′,7′-二氯荧光素双乙酸盐,使其终浓度为1 μmol/L,避光孵育30 min后,200目筛网过滤,用多功能酶标仪,激发485 nm,发射535 nm,测定其荧光值。2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐穿过细胞膜进入细胞后,被酯酶水解生成二氯二氢荧光素,二氯二氢荧光素不能穿透细胞膜,就被留在细胞内,细胞内的活性氧氧化无荧光的二氯二氢荧光素生成有荧光的二氯荧光素。二氯荧光素的平均荧光量可代表呼吸爆发活性。

1.4.5 白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α活性的测定

肝脏中白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α的活性主要是通过双抗体夹心法来测定,采用购于IBL(德国)公司的白细胞介素-1β Elisa检测试剂盒和肿瘤坏死因子-α ELISA检测试剂盒完成测定。

1.4.6 补体替代途径溶血(ACH50)活性测定

补体替代途径溶血活性主要参照文献[10-11]的方法,略加修改进行测定。将血清和乙二醇双氨基四乙酸-Mg2+-明胶巴比妥缓冲液按不同比例混合,加入0.1 mL红细胞,在25 ℃水浴下孵育90 min后,4000 r/min离心(离心半径20 cm)10 min,取上清液,测吸光度(414 nm),计算各管修正值,算出溶血率为50%所需稀释补体的体积(mL),换算出的浓度补体量,即为1个ACH50单位。

1.4.7 肝脏中抗氧化蛋白基因的相对表达水平测定

抗氧化蛋白基因的表达水平测定方法与文献[12]的方法相似,各引物信息见表2。应用2-ΔΔCt法,基准为60 mg/kg姜黄素添加组的基因表达水平。

表2 PrxⅠ、PrxⅡ、PrxⅢ、PrxⅣ、PrxⅤ、PrxⅥ基因荧光定量PCR引物Tab.2 Primers for real time PCR analysis of PrxⅠ, PrxⅡ, PrxⅢ, PrxⅣ, PrxⅤ, and PrxⅥ genes

1.5 数据处理

试验数据用SPSS 17.0软件进行统计分析。用单因子方差分析及邓肯多重比较检验各试验组间差异显著性,P<0.05为差异显著,数据用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 姜黄素对大口黑鲈生长及形体指标的影响

经过60 d的养殖试验(表3),随着姜黄素含量的升高,大口黑鲈质量增加率及特定生长率先升后降。60 mg/kg的姜黄素显著提高了大口黑鲈的质量增加率及特定生长率(P<0.05)。60 mg/kg姜黄素组饲料系数最低,显著低于对照组(P<0.05)。同时,各组间鱼体肝体指数、脏体指数及存活率差异不显著(P>0.05)。

表3 姜黄素对大口黑鲈生长性能和形体指标的影响Tab.3 Effects of curcumin on growth performance of largemouth bass M. salmoides

2.2 姜黄素对大口黑鲈血液指标的影响

白细胞密度随着姜黄素含量的增加呈先升后降的趋势,30 mg/kg和60 mg/kg姜黄素组白细胞数显著增加(P<0.05)(表4)。此外,各组间鱼体血红蛋白质量浓度及血红细胞数差异不显著(P>0.05)。

表4 姜黄素对大口黑鲈血液指标的影响Tab.4 Effects of curcumin on haematological analyses of largemouth bass M. salmoides

2.3 姜黄素对大口黑鲈生理生化指标的影响

随着姜黄素添加量的增多,大口黑鲈谷丙转氨酶及谷草转氨酶活性呈先降后升的趋势,60 mg/kg姜黄素显著降低了谷丙转氨酶活性(P<0.05),30 mg/kg和60 mg/kg组谷草转氨酶活性显著低于对照组(P<0.05);30 mg/kg和60 mg/kg姜黄素但大口黑鲈白蛋白质量浓度较高(表5)。而各组间鱼体总蛋白、乳酸脱氢酶、球蛋白含量无显著差异(P>0.05)。

表5 姜黄素对大口黑鲈生理生化指标的影响Tab.5 Effects of curcumin on biochemical indices of largemouth bass M. salmoides

2.4 姜黄素对大口黑鲈非特异性免疫指标的影响

各组之间细胞呼吸爆发活性差异不显著(P>0.05)(图1);各组添加的姜黄素均显著提高了肿瘤坏死因子-α的活性(P<0.05)(图2);60 mg/kg姜黄素显著提高了白细胞介素-1β活性(P<0.05)(图3);30、60 mg/kg和120 mg/kg姜黄素显著提高了补体替代途径活性(P<0.05)(图4)。

图1 姜黄素对大口黑鲈呼吸爆发活性的影响Fig.1 Effects of curcumin on respiratory burst activity of largemouth bass M. salmoides

图2 姜黄素对大口黑鲈肿瘤坏死因子-α活性的影响Fig.2 Effects of curcumin on TNF-α activity of largemouth bass M. salmoides

图3 姜黄素对大口黑鲈白细胞介素-1β活性的影响Fig.3 Effects of curcumin on IL-1β activity of largemouth bass M. salmoides

图4 姜黄素对大口黑鲈补体替代途径活性的影响Fig.4 Effects of curcumin on ACH50 activity of largemouth bass M. salmoides

2.5 姜黄素对大口黑鲈抗氧化蛋白基因的影响

和对照组相比,60、120 mg/kg和240 mg/kg姜黄素显著提高了肝脏中PrxⅠ基因的表达水平(P<0.05)(图5a);60 mg/kg和120 mg/kg姜黄素显著提高了肝脏中PrxⅡ基因的表达水平(P<0.05)(图5b);与对照组相比,各组姜黄素均显著提高了PrxⅣ、PrxⅤ基因表达水平(P<0.05)(图5d、5e);15、30 mg/kg和60 mg/kg姜黄素显著提高了PrxⅥ基因的表达水平(P<0.05)(图5f)。

图5 姜黄素对大口黑鲈Prx mRNA表达水平的影响Fig.5 Effects of curcumin on relative expression level of Prx mRNA of largemouth bass M. salmoides

3 讨 论

3.1 姜黄素对大口黑鲈生长性能的影响

在对尼罗罗非鱼等的研究中发现,姜黄素可以通过提高肠道消化酶活性,促进吸收饲料中的营养物质,从而提高饲料利用率[6]。本试验结果显示,在大口黑鲈日粮中添加60 mg/kg的姜黄素,可显著提高大口黑鲈特定生长率和质量增加率,降低饵料系数。其原因应该是日粮中60 mg/kg的姜黄素,提高了肠道内的消化酶活性,日粮中的营养物质能被更好地消化吸收,从而提高了大口黑鲈的特定生长率和质量增加率,这与对大鼠[13]、小鼠[14]、尼罗罗非鱼[6]等的研究结果一致。

日粮中过量添加姜黄素对大口黑鲈生长性能产生不良影响。这与对罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)[15]、建鲤(Cyprinuscarpiovar.jian)[16]、尼罗罗非鱼[17]的研究报道一致。过量添加姜黄素产生不利影响的原因可能是:过量添加会导致饲料适口性变差,影响养殖对象摄食水平;也可能与过量的姜黄素促氧化作用有关[18];另外,姜黄素还会对肠道菌群有负面影响,从而影响消化吸收。此外,姜黄素添加水平对大口黑鲈肝体指数、脏体指数、存活率和肥满度无显著影响,说明姜黄素是一种低毒的优质膳食补充剂,此结果与胡忠泽等[19-20]关于姜黄素化学成分和毒性研究结果一致。

3.2 姜黄素对大口黑鲈血液及生理生化指标的影响

血液生化指标检测已广泛应用于水产养殖研究中。其中,白细胞作为血液中消除有害微生物的第一道防线,被认为是非特异性免疫中最主要的物质之一,是机体免疫功能和健康状况正常与否的重要指标。本试验中,添加60 mg/kg的姜黄素显著提高了大口黑鲈血液中白细胞数量,这与在虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[21]上的研究结果相同,说明姜黄素可能会刺激机体产生免疫反应,从而提高机体免疫功能。本试验中,各组血红蛋白含量和红细胞数无显著差异,这与对虹鳟、斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)[22-23]的研究结果不同,可能是因为不同物种、不同养殖密度、不同养殖阶段、不同姜黄素添加量等都会对试验结果产生差异,具体的反应机制还需进一步研究。

白蛋白及总蛋白含量增加表明机体的先天免疫功能增强[22,24]。本试验中,添加姜黄素提高了大口黑鲈血清中白蛋白含量,这与对尖吻鲈(Latescalcarifer)[25]的研究结果一致。一般来说,谷丙转氨酶活性增加说明肝脏受到一定程度损伤[26],大口黑鲈日粮中添加60 mg/kg姜黄素降低了血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性,与在草鱼(Ctenopharyngodonidella)[27]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[28]、尼罗罗非鱼[29]中的变化趋势一致。这表明适当添加姜黄素可降低血清中的转氨酶活性,对肝脏有一定的保护作用。这可能与姜黄素中具有的二酮和酚羟基基团有关,这种特有结构能够有效清除氧化自由基,提高机体的抗氧化能力[30],保护肝脏。

3.3 姜黄素对大口黑鲈炎症因子的影响

呼吸爆发又称为氧爆发,是再灌注时自由基生成的重要途径之一,也是机体免疫反应的重要组成部分。本试验结果表明,60 mg/kg姜黄素可提高大口黑鲈的细胞呼吸爆发活性,这与对团头鲂[31]的研究结果一致。白细胞介素-1β是机体发生炎症反应的重要介质,在本试验中饲料添加60 mg/kg姜黄素显著提高了白细胞介素-1β活性。但有相关研究报道,姜黄素对细胞中的白细胞介素-1β表达有抑制作用[32]。大部分机体的肝脏受损均可能会刺激诱导细胞产生肿瘤坏死因子-α,以清除受损肝细胞并促进细胞发生愈合反应[33]。鱼体中肿瘤坏死因子-α是由白细胞产生的活化因子,能够改善呼吸爆发活性、激发巨噬细胞吞噬活性[34],这也与本试验中的白细胞含量增高相符。本试验中,随着姜黄素含量的增加,白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α活性升高。肿瘤坏死因子-α是典型的促炎因子,机体在应激状态下发生内分泌紊乱和激素水平的异常,也会使机体肿瘤坏死因子-α活性升高[35]。肝脏白细胞介素-1β具有广泛的免疫调节作用,能够分泌免疫球蛋白及介导炎症反应等[36]。因本试验中大口黑鲈的白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α与其他报道的变化趋势不同,故大胆推测可能是大口黑鲈有炎症或是有其他应激反应,具体的原因还需要进一步的研究。补体替代途径是机体中关键的杀菌机制[37],本试验结果显示,补体替代途径溶血活性在60 mg/kg姜黄素组显著增强。以上结果表明,姜黄素可有效缓解肝脏炎症。可能的原因是:姜黄素通过抑制一氧化碳和活性氧信号的释放,从而减少中性粒细胞的渗漏[38];直接调控巨噬细胞或抑制核转录因子信号通路,减少了炎症因子的释放,从而缓解炎症反应[39]。

3.4 姜黄素对大口黑鲈抗氧化蛋白基因表达的影响

Prx是一类常见的过氧化物酶,共有6个成员,分别为PrxⅠ、PrxⅡ、PrxⅢ、PrxⅣ、PrxⅤ、PrxⅥ,均具有清除细胞中过多氧自由基的作用,可以将细胞中过多的过氧化氢还原为水,从而清除机体内过多的活性氧分子[40]。本试验中,随着大口黑鲈饲料中姜黄素添加水平的不断提高,抗氧化蛋白基因表达水平均呈现先升后降的趋势,表明一定水平的姜黄素可提高大口黑鲈肝脏的抗氧化功能,并且添加60 mg/kg的姜黄素效果最为显著。可能的原因是:姜黄素结构中的酚羟基基团能够清除自由基,有利于机体对过氧化氢、活性氧和脂质氢过氧化物等的清除,从而间接降低了脂质过氧化损伤[41]。

4 结 论

综上所述,大口黑鲈日粮中适当添加姜黄素能显著提高鱼体生长性能、免疫功能和抗氧化水平,降低炎症因子水平,且日粮中60 mg/kg姜黄素添加量为大口黑鲈的最适添加水平。