牙鲆抗淋巴囊肿系肌肉营养成分的分析

王桂兴,何忠伟,刘玉峰,张晓彦,赵雅贤,任玉芹,王玉芬,侯吉伦

( 中国水产科学研究院 北戴河中心实验站,河北 秦皇岛 066100 )

牙鲆(Paralichthysolivaceus)是重要的海水养殖鱼类,具有个体大、生长快、味道鲜美等特点,深受广大消费者的喜爱。牙鲆雌性生长速度显著快于雄性,通过人工诱导雌核发育技术制备的全雌牙鲆已经在生产上得到了广泛的应用[1-3]。人工诱导雌核发育技术同时还能够快速提高牙鲆的纯合度和遗传相似度[4-5],是快速建立鱼类近交系的有效方法[6]。近交系的杂交后代具有明显的杂种优势[7-8],利用雌核发育技术[3]和杂种优势能够快速地选育出具有优良生长性状、抗逆性状以及高品质的新品种[9]。

随着牙鲆养殖业的快速发展,病害问题也日益凸显。在众多病害中,由DNA病毒所引发的淋巴囊肿病对牙鲆养殖产业造成了严重的影响[10]。笔者团队针对淋巴囊肿病开展抗病新品种选育,并筛选到了抗病保护率在80%以上的家系2个[11]。以此为基础,进一步利用人工雌核发育技术制备了上述2个家系的近交系,并进行杂交,其子代经淋巴囊肿病毒染毒养殖后的抗病保护率均逾90%(未发表中试试验数据),具有良好的抗病性能。

牙鲆作为我国北方重要的海水养殖鱼类,其营养成分也是评价新品种养殖潜力的一个重要指标。目前鱼类肌肉营养价值研究已在主要海水养殖鱼类中广泛开展,如大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[12-13]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[14-17]、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)[18-20]、红鳍东方鲀(Takifugurubripes)等[21-22]。在牙鲆上,开展了野生牙鲆与养殖牙鲆的肌肉营养比较[23-24],雌核发育牙鲆与普通牙鲆肌肉的营养比较[25],以及不同生长环境[26]、不同规格[15]、不同饵料饲养[27]的牙鲆肌肉营养的分析比较,但关于抗病新品系肌肉营养成分分析的报道较少。笔者分析对比牙鲆抗淋巴囊肿品系及其亲本系的肌肉营养成分、氨基酸和脂肪酸的含量及组成,旨在为牙鲆抗淋巴囊肿病新品种选育和推广提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

北戴河中心实验站在2016年选育出2个抗淋巴囊肿家系,2020年将2个家系作为亲本进行杂交制备出牙鲆抗淋巴囊肿品系,同时诱导了2个亲本家系的减数分裂雌核发育系,进行亲本扩繁。所用试验鱼为2个亲本抗淋巴囊肿系雌核发育后代及其杂交系(抗淋巴囊肿系),3系均在中国水产科学研究院北戴河中心实验站内进行工厂化流水养殖,养殖池面积为25 m2,养殖时间为2020年4月—2020年11月,养殖密度每月进行一次标准化,使各池养殖条件基本保持一致,全程投喂东丸牌鲆鲽类苗种专用饲料,水温17～25 ℃,pH 7.8～8.3,溶解氧8.0～10.0 mg/L。养殖密度约为10 kg/m2,日投喂2次(8:00和16:00),投饵量为体质量的2%。2020年11月采样时试验鱼为7月龄,规格分别为:母系体质量(219.88±33.82) g,体长(24.38±1.56) cm;父系体质量(213.53±27.20) g,体长(23.76±1.68) cm;抗淋巴囊肿系体质量(237.51±26.04) g,体长(24.61±0.94) cm。

饲料成分:粗蛋白≥52.0%,粗脂肪≥8.0%,赖氨酸≥3.0%,总磷≥1.5%,粗纤维≤3.0%,粗灰分≤16.0%,钙≤2.0%,水分≤10.0%。

1.2 样品采集与处理

每个家系分别随机挑选无病无伤的试验鱼9尾,鲜活取样,切断鳃盖骨后缘的颈椎骨处死,放血后,取鱼体两侧全部肌肉组织作为样品,取样过程在冰盘上完成。再随机将3尾试验鱼的肌肉组织样品混合,使每个家系保有3个样本,样本量大于100 g,-80 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.3 常规营养成分的测定

粗蛋白含量参照GB 5009.5—2016(第一法)测定,粗脂肪含量参照GB 5009.6—2016(第二法)测定,粗灰分含量参照GB 5009.4—2016(第一法)测定,水分含量参照GB 5009.3—2016(第一法)测定。

1.4 氨基酸和脂肪酸的测定

色氨酸含量测定:样品采用4.2 mol/L氢氧化钠水解26 h,调节pH,使用戴安U3000高效液相色谱仪测定。胱氨酸含量测定:参照GB 5009.124—2016,用6 mol/L盐酸水解22 h后,盐酸水解液采用过氧甲酸氧化48 h,蒸干复溶后使用日立L-8900全自动氨基酸分析仪测定。其他16种氨基酸含量也参照GB 5009.124—2016,用6 mol/L盐酸水解22 h后,蒸干复溶后使用日立L-8900全自动氨基酸分析仪测定。

脂肪酸含量参照GB 5009.168—2016(内标法),使用岛津气相色谱仪GC-2010测定。

1.5 营养价值的评定

营养价值依据联合国粮食及农业组织/世界卫生组织的氨基酸评分标准模式[28]和鸡蛋蛋白标准模式[29]进行评价。氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)和必需氨基酸指数(EAAI)按下式计算:

(1)

(2)

(3)

(4)

式中,waa为样品的氨基酸含量(%),wcp为样品的粗蛋白含量(%),wa为氨基酸含量(mg/g,以N计),wFAO/WHO为联合国粮食及农业组织/世界卫生组织评分模式中同种氨基酸含量,wEgg为鸡蛋蛋白同种氨基酸含量(mg/g,以N计),A…I为样品蛋白质的必需氨基酸含量(mg/g,以N计),AE…IE为鸡蛋蛋白的必需氨基酸含量(mg/g,以N计),n为氨基酸数。

1.6 数据分析方法

试验数据以平均值±标准差表示,采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析及LSD法进行组间多重比较,显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 肌肉常规营养成分分析

抗淋巴囊肿系及亲本系的肌肉粗蛋白质含量为19.80%～20.83%,粗脂肪含量为0.73%～1.27%,粗灰分含量为1.30%～1.37%,水分为76.83%～77.63%。3系肌肉在粗蛋白质、粗灰分、水分上含量差异不显著,但粗脂肪含量上母系(1.27%)显著高于抗淋巴囊肿系(0.73%)和父系(0.90%)(P<0.05)(表1)。

表1 牙鲆淋巴囊肿系及亲本系肌肉常规营养成分对比(鲜样) %Tab.1 Comparison of muscular proximate nutrient compositions (fresh weight) among hybrid and its parental strains of bastard halibut

2.2 肌肉蛋白质中氨基酸含量与营养评价

本试验中,抗淋巴囊肿系及其亲本系中均检测到18种氨基酸(表2),其中必需氨基酸8种、半必需氨基酸2种、非必需氨基酸8种和鲜味氨基酸4种。氨基酸总量为18.82%～20.09%,其中含量最高的是谷氨酸(3.12%～3.29%),其次是天冬氨酸(2.03%～2.20%)、赖氨酸(1.82%～1.92%),色氨酸(0.14%～0.17%)含量均最低。必需氨基酸中,赖氨酸含量最高(1.82%～1.92%),色氨酸最低(0.14%～0.17%);3系中必需氨基酸、鲜味氨基酸和氨基酸总量均为抗淋巴囊肿系>母系>父系,但差异不显著(P>0.05);3系间只有色氨酸和酪氨酸含量差异显著(P<0.05),而其他16种氨基酸含量均差异不显著(P>0.05);抗淋巴囊肿系及亲本系的必需氨基酸/总氨基酸分别为40.92%、40.86%和40.94%,必需氨基酸/非必需氨基酸分别是79.88%、79.77%、80.24%,3系间差异不显著(P>0.05)。

表2 牙鲆抗淋巴囊肿系及亲本系氨基酸含量(鲜样) %Tab.2 Amino acid composition and contents in muscle of hybrid and parental strains (fresh weight) in bastard halibut

2.3 必需氨基酸组成评价

必需氨基酸含量换算成每克氮中含氨基酸毫克数后,结果见表3。3系的必需氨基酸含量与联合国粮食及农业组织/世界卫生组织及鸡蛋蛋白质标准模式对比,结果显示,抗淋巴囊肿系必需氨基酸总量(2945 mg/g)>父系(2702 mg/g)>母系(2667 mg/g),均高于联合国粮食及农业组织/世界卫生组织的标准(2250 mg/g),但低于鸡蛋蛋白模式(3059 mg/g)。必需氨基酸指数抗淋巴囊肿系(87.40)显著高于母系(79.86)和父系(79.04)(P<0.05),而亲本间差异不显著(P>0.05)。氨基酸评分、化学评分结果显示:抗淋巴囊肿系高于亲本系,其中赖氨酸分值最高,亮氨酸次之,二者含量超过联合国粮食及农业组织/世界卫生组织标准和鸡蛋蛋白模式;第一限制性氨基酸为色氨酸(表4)。

表3 牙鲆抗淋巴囊肿系及其亲本系必需氨基酸组成评价Tab.3 Comparison and evaluation of the essential amino acid content in bastard halibut P. olivaceus hybrids and parental strains

表4 牙鲆抗淋巴囊肿系及其亲本系必需氨基酸组成的评价Tab.4 Evaluation of essential amino acid composition of bastard halibut P. olivaceus hybrids and parental strains

2.4 脂肪酸组成分析

本试验中,3系共计含有16种脂肪酸,其中饱和脂肪酸3种,单不饱和脂肪酸4种,多不饱和脂肪酸5种,3类脂肪酸总含量为单不饱和脂肪酸>饱和脂肪酸>多不饱和脂肪酸。母系脂肪酸数量(16种)>父系(14种)>抗淋巴囊肿系(12种),抗淋巴囊肿系和父系中均未检测出花生酸和顺,顺-11,14-二十碳二烯酸,抗淋巴囊肿系还未检出十五碳酸和珠光脂酸。饱和脂肪酸组成中,含量最高的脂肪酸均为棕榈酸,单不饱和脂肪酸组成中含量最高的为油酸,多不饱和脂肪酸组成中含量最高为二十二碳六烯酸。单个脂肪酸上含量较高的依次为二十二碳六烯酸、棕榈酸和亚油酸,含量较低为十五碳酸、珠光脂酸和花生酸等。3类脂肪酸含量在3系间差异显著(P<0.05),且均为母系>父系>抗淋巴囊肿系。二十二碳六烯酸+二十碳五烯酸总含量为母系(359.33 mg/100 g)>父系(313.80 mg/100 g)>抗淋巴囊肿系(253.70 mg/100 g),且差异显著(P<0.05)。

表5 牙鲆抗淋巴囊肿系及其亲本系脂肪酸组成及含量(鲜样) mg/100 gTab.5 Composition and contents (fresh weight) of fatty acids of hybrids and parental strains of bastard halibut P.olivaceus

3 讨 论

笔者团队利用雌核发育方法建立牙鲆家系,并选育出2个抗淋巴囊肿病家系作为亲本。本试验中,以牙鲆抗淋巴囊肿系及其亲本的雌核发育系为研究对象,对3系的肌肉营养成分,氨基酸和脂肪酸的含量和组成进行分析比较,为利用雌核发育技术选育牙鲆抗病新品系提供基础数据,以期选育出更加优质的牙鲆抗病新品种。

3.1 抗淋巴囊肿系及其亲本系的常规营养分析

在鱼体肌肉品质评价中,肌肉的营养成分组成和含量起着重要作用,其中蛋白质和脂肪含量决定了其营养价值。本试验中,抗淋巴囊肿牙鲆3系间粗蛋白含量无显著差异,并且与已报道的雌核发育牙鲆(21.34%)[25]、养殖牙鲆[26](网箱19.6%,工厂化19.8%,池塘20.03%)及野生牙鲆(19.9%)[30]相近,高于大黄鱼(16.55%)[12]、大菱鲆(16.91%)[17]和半滑舌鳎(17.17%)[20]等其他海水鱼类。而粗脂肪含量母系(1.27%)显著高于父系(0.90%)和抗淋巴囊肿系(0.73%)。根据鱼体脂肪含量,可将鱼类分为少脂型(<2%)、低脂型(2%～<4%)、中脂型(4%～<8%)和高脂型(≥8%)4大类[31]。本试验中,3系脂肪含量均小于2%,属于少脂型。可见牙鲆抗淋巴囊肿系及其亲本家系的肌肉具有高蛋白低脂肪的特点,营养品质较高,符合现代人们对健康食品的要求。

本试验中,牙鲆抗淋巴囊肿系作为杂交子一代,在粗蛋白含量上略低于父本系,而显著低于母系。杂交黄颡鱼(Pelteobagrusvachell♀×P.fulvidraco♂)“黄优1号”[32]粗脂肪含量虽低于双亲,但差异不显著;牙鲆(♀)×犬齿牙鲆(P.dentatus)(♂)杂交子一代[33]、小黄鱼(L.polyactis)♀×大黄鱼♂杂交子一代[13]和杂交云龙斑(Epinehelusmoara♀×E.lanceolatus♂)[34]的粗脂肪含量介于双亲之间;赤点石斑鱼(Epinephelusakaara)与鞍带石斑鱼(E.lanceolatus)杂交子一代[35]高于父本,与母本相当;杂交鳢(Channaargus♀×C.maculata♂)[36]则显著高于双亲;黑鲷(Acanthopagrusschlegelii)与真鲷(Pagrusmajor)正反交后代[37]结果显示,正交后代高于双亲,而反交后代介于亲本之间。以上报道中杂交后代粗脂肪含量大多表现出中亲或超亲优势,与本试验结果存在差异,可能是因为这些杂交子一代均为远缘杂交后代,一般情况下后代具有杂种优势,而本试验中牙鲆抗淋巴囊肿系为近交系的杂交后代,由于不同亲本间配合力不同,导致后代杂种优势的差异,这需要在后续的研究中进一步探讨。

3.2 氨基酸及营养评价

抗淋巴囊肿系及亲本系均含有18种氨基酸,其中以抗淋巴囊肿系含量最高,氨基酸的种类和含量与普通牙鲆[30]、雌核发育牙鲆[25]以及不同养殖模式的牙鲆[26]相似。

必需氨基酸含量和比例决定了蛋白质的营养价值。根据联合国粮食及农业组织/世界卫生组织氨基酸理想模式,必需氨基酸/总氨基酸约为40%、必需氨基酸/非必需氨基酸在60%以上为高质量氨基酸[28]。本试验中,3系必需氨基酸/总氨基酸分别为39.75%、40.79%和40.81%,必需氨基酸/非必需氨基酸分别为79.59%、79.56%和86.92%,均符合理想氨基酸模式的要求,氨基酸平衡效果较为合理。抗淋巴囊肿系必需氨基酸含量(2945 mg/g)和必需氨基酸指数(87.40)均高于亲本系,必需氨基酸含量大于联合国粮食及农业组织/世界卫生组织标准值(2250 mg/g),必需氨基酸指数分值超过牙鲆已报道的结果[24-27,30],表明抗淋巴囊肿系肌肉蛋白质品质较高。与其他海水鱼相比,本试验中的抗淋巴囊肿系牙鲆的必需氨基酸指数高于大黄鱼(62.1～77.9)[12]、红鳍东方鲀(76.61～77.61)[22]、鲑鳟鱼(84.40～86.56)[38]和七带石斑鱼(E.septemfasciatus)(82.38)[39],但低于大菱鲆(98.00)[14]。除必需氨基酸外,鲜味氨基酸含量也是评价鱼肉营养品质的重要指标之一,主要影响鱼肉的鲜味程度,其包含的4种氨基酸分别为天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸。4种鲜味氨基酸总量抗淋巴囊肿系(7.77%)高于父系(7.29%)和母系(7.42%),但差异不显著(P<0.05),其中谷氨酸含量(3.12%～3.29%)较高。谷氨酸不仅是鲜味氨基酸,还是脑组织生化代谢中的重要氨基酸,参与多种生理活性物质的合成[40]。这说明牙鲆抗淋巴囊肿品系具有较高的营养与保健价值。以上分析表明,抗淋巴囊肿系作为牙鲆近交系杂交后代,在氨基酸总量、必需氨基酸含量、鲜味氨基酸含量和必需氨基酸指数上略优于亲本系。此结果与小黄鱼♀×大黄鱼♂杂交子代[13]、褐牙鲆♀×犬齿牙鲆♂杂交子一代[33]、杂交黄颡鱼[32]及杂交鳢[36]等研究结果类似,杂交后代优于双亲。现有研究表明,牙鲆雌核发育杂交系在生长上具有显著杂交优势[3],而抗淋巴囊肿系正是由2个雌核发育系杂交而来,其氨基酸含量和必需氨基酸指数较高也可能源于杂种优势。

3.3 脂肪酸含量分析

本试验中牙鲆抗淋巴囊肿系及亲本系肌肉含有3种饱和脂肪酸、4种单不饱和脂肪酸、5种多不饱和脂肪酸,共计16种。其脂肪酸数量虽少于南极冰鱼(Channichthysmithridatis)[41],但二者均具有深海冷水鱼类特征,多不饱和脂肪酸含量丰富,尤其是二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸含量高。而脂肪酸的不饱和度决定了脂肪的质量,其中二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸属n-3长链高不饱和脂肪酸,属于人体必需的多不饱和脂肪酸,是营养价值评价的重要指标,可以预防心脑血管疾病,有助于大脑的发育[42]。3系的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸含量丰富,均在250 mg/100 g以上,此结果高于半滑舌鳎[20]、大菱鲆[17,19]、雌核发育牙鲆和普通牙鲆[25,30]等鲆鲽类,也高于大黄鱼[12-13]、河鲀[21]和七带石斑鱼[39]等其他主要海水养殖鱼类。

3系脂肪酸种类和含量上,均为母系>父系>抗淋巴囊肿系,尤其是母系多不饱和脂肪酸含量最丰富,其中二十二碳六烯酸含量最高,这与粗脂肪含量结果相符。而抗淋巴囊肿系不饱和脂肪酸含量均低于双亲,与其他鱼类杂交后代的结果比较不尽相同,如:大黄鱼、小黄鱼的杂交子一代[13]介于双亲之间;杂交云龙斑[34]和杂交黄颡鱼“黄优1号”[32]均高于双亲;赤点石斑鱼与鞍带石斑鱼杂交子一代[35]与母本相当,高于父本;而牙鲆(♀)×犬齿牙鲆(♂)杂交子一代[33]与本研究结果类似,均低于双亲。现有的关于鱼类杂交后代不饱和脂肪酸含量的结果表明,杂交后代并不总是表现出杂种优势。导致这些结果的原因需进一步探讨,鱼类的养殖水温、饵料等环境因素均能影响鱼类的摄食、生长及代谢,进而对鱼体脂肪含量及脂肪酸组成造成影响。

4 结 论

牙鲆抗淋巴囊肿系含有18种氨基酸,含量略高于亲本系,氨基酸平衡效果合理,符合人体必需氨基酸需求。同时3系具有较高的脂肪酸营养价值,其中母系多不饱和脂肪酸,尤其是二十二碳六烯酸+二十碳五烯酸含量最丰富,可作为脂肪酸选育目标的候选材料。