不同pH下五溴联苯醚BDE-85对海水小球藻的毒性效应

姜乐乐,郝梦秋,顾小朵,郭晨宇,李富田,王洪斌

( 江苏海洋大学 海洋科学与水产学院,江苏 连云港 222005 )

随着工农业快速发展,海洋环境污染已然是全球性的问题,自上世纪后期以来,多溴联苯醚(PBDEs)在各类工业产品中当作阻燃剂被普遍使用,虽然它的应用起始阶段比较晚,急性毒性低,但其持久污染性导致的慢性毒性很严重,也可沿着食物链富集,光化学降解是环境中多溴联苯醚的重要降解途径之一[1]。五溴联苯醚BDE-85性质稳定且难以降解,焚烧或浸泡含有PBDE-99的工业废物,能使其通过蒸发和渗漏等进入环境中,在水体、大气、土壤、海洋生物及人体等生物和非生物样本中均能检测到BDE-99[2-8],研究证明,多溴联苯醚对乳腺癌细胞的相关肿瘤的发生和发展有一定的影响[9]。李玉芳等[10]在沿海鱼类体内均检出高含量的低溴代的PBDE-47和高溴代的PBDE-209,后者在某些水产品的检出率和检出剂量有逐年上升的趋势。现已证实,多溴联苯醚可以通过食物链在海洋生物的体内富集并且产生毒性效应[11]。海洋微藻作为初级生产者,多溴联苯醚对它有更强的急性毒性和遗传毒性,虽然由于微藻细胞壁结构的差异导致富集能力不同,但对其抗氧化防御系统的破坏作用也较强[12],并且微藻体内的多溴联苯醚的富集与氮磷比、营养盐浓度、氮浓度等环境因子密切相关[13-17]。目前关于多溴联苯醚对海洋微藻毒性胁迫效应的研究鲜有报道,国内研究也刚起步,主要分析微藻在受到多溴联苯醚的胁迫后,其生长状况、光合系统和抗氧化防御系统在暴露后的响应[18]。不同海洋微藻对多溴联苯醚的响应具有差异性[18]。

随着人类活动的干预,排放的大量CO2通过海气界面进入海洋,打破海洋原有的碳酸盐平衡进而造成海洋酸化。海洋酸化直接导致海洋中污染物的理化性质改变与毒性效应增强。如海洋酸化能够影响重金属的溶解并改变其离子形态与比例[19]、抑制有机污染物的降解[20],影响微塑料的吸附行为等[21],进而引发毒性效应的改变。全球气候变化下的污染物海洋生物效应为当前环境领域关注的热点和前沿问题,笔者聚焦不同pH条件下的多溴联苯醚对海水小球藻(Chlorellavulgaris)的毒性效应,探讨pH和污染物双重胁迫对小球藻的生长、光合作用和氧化应激效应的影响等,旨为海洋污染防控及管理决策提供参考。

1 材料与方法

1.1 藻种来源

试验用海水小球藻为江苏海洋大学海洋藻类生物学研究室保存藻种。小球藻培养采用人工海水,配方:NaCl 490.80 g,KBr 2.00 g,KCl 14.00 g,H3BO30.06 g,Na2SO481.80 g,NaHCO33.70 g,NaF 0.06 g,CaCl2·2H2O 30.80 g,MgCl2·6H2O 222.00 g,SrCl2·6H2O 0.34 g,ddH2O 20 L。小球藻培养基采用通用的f/2营养液。

1.2 试剂

超氧化物歧化酶、过氧化氢酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;五溴联苯醚选取的试剂为BDE-85(C12H5Br5O),购于上海源叶生物科技有限公司,需溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中配制成母液(25 μg/mL)使用(已有研究表明,N,N-二甲基甲酰胺对藻类的生长没有影响[22]);其他试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计

小球藻的培养条件:光照培养箱培养(GXZ-500C,宁波江南仪器厂),光照周期为12L∶12D,培养温度为25 ℃,培养光照度为8300 lx。pH梯度设置:8.66、8.44、8.19、7.93,pH梯度通过HCl和NaOH调节,pH计(Seven Easy, METTLER)测定。BDE-85含量梯度设置[22]:0、1.52、3.04、6.08、12.16、24.32 μg/g,每个含量设置3个平行。人工海水经高压灭菌锅(YXQ-LS-50SH,上海博讯实业有限公司)105 ℃灭菌15 min,500 mL PC瓶100 ℃灭菌5 min,按1000∶1(体积比)加入过滤除菌的f/2营养液,藻种活化2～3 d达到指数生长期,接种密度约为2.5×104个/mL的小球藻藻液1 mL至500 mL的培养液中,接种密度达50个/mL,摇匀后置于光照培养箱培养2 d后取样观察。向对应的BDE-85含量梯度培养瓶中,分别加入BDE-85母液,使各组终含量分别为0、1.52、3.04、6.08、12.16、24.32 μg/g,每隔24 h取样进行测定分析(取100 mL培养藻液浓缩藻密度至约100×104个/mL),培养期间及时补充营养液,使小球藻生长始终保持在对数生长期,并且等比例加入BDE-85,调节并保持培养过程中培养液的pH不变,保持藻液密度约为3×104个/mL。在加入BDE-85的24 h后,开始持续3 d测定超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性(试剂盒检测,南京建成生物工程公司;全波长酶标仪,ReadMax1900,上海闪谱生物科技有限公司),连续5 d测定生长量,第4天测定光合放氧速率和叶绿素荧光参数等。小球藻培养期间,每天振摇数次,随机调换培养瓶位置,并在固定时间取样分析。试验过程中所有操作均严格控制在无菌条件下进行(超净工作台,SW-CJ-ZF,苏州净化设备有限公司)。

1.3.2 比生长速率测定

连续5 d测定生长量,取浓缩藻液2～3 mL,立刻加入鲁哥试剂固定,保存于4 ℃冰箱中,便于后续计数,计算比生长速率。将固定后的藻液充分摇匀后,取100 μL使用0.1 mL浮游计数板(DSJ-01,厦门登迅仪器设备有限公司)在显微镜下计数,每个样品每次计数重复3次,降低计数的试验误差。比生长速率按下式计算:

μ=( lnN1-lnN0)/(t1-t0)

式中,N1为当天计数所得每毫升藻液中所含藻量,N0为前一天或前几天计数所得每毫升藻液中所含藻量,t1-t0为两次计数之间所隔时间。

1.3.3 超氧化物歧化酶及过氧化氢酶活性测定

无菌条件下取1 mL待测浓缩藻液,放置在1.5 mL的离心管中,4 ℃、5000 r/min离心(离心半径7.5 cm)10 min,弃去上清液,沉淀物加1 mL生理盐水,超声波破碎法[23]破碎海水小球藻细胞(HD2200,宁波新芝生物科技股份有限公司;破碎条件:功率195 W,超声波工作时间3 s,间歇时间7 s,破碎强度65%,工作时间10 min),显微镜下观察到无完整藻细胞后,再次离心,离心参数同上,取上清液检测超氧化物歧化酶及过氧化氢酶活性。按检测试剂盒说明书进行。

1.3.4 净光合放氧速率和暗呼吸速率测定

使用液相氧电极(17304,汉莎科学仪器有限公司)来测定海水小球藻的光合放氧和呼吸耗氧速率,注意8300 lx的光照度点及保持压强在0.02 MPa以下,防止微藻破裂死亡,并且保证每次加入的测定藻样液为2 mL,藻液的细胞密度要通过显微镜精准计数,以供计算速率时所需。

1.3.5 叶绿素荧光参数测定

将浓缩的待测藻液3 mL放入叶绿素荧光测定仪(PAM,AP100,捷克)的比色皿中,光照度设置为8300 lx,先测定藻细胞活性(QY),再测定其快速光响应曲线(RLC),利用公式计算相对电子传递速率(rETR):

rETR= PAR×Y×0.5

式中,PAR为光合有效辐射,Y为光系统Ⅱ的有效光化学量子产量。

快速光响应曲线拟合使用的公式:

rETR=PAR/(a×PAR2+b×PAR+c)

式中,a、b、c均表示拟合曲线中的常数。

通过a、b、c的值计算电子传输效率(α)、rETR的最大值(rETRmax)和饱和辐照点(Ik):

α=1/c

rETRmax=1/[b+2(a×c)1/2]

Ik=c/[b+2(a×c)1/2]

1.3.6 数据分析

试验数据使用Origin 2018软件分析处理作图,用不同字母表示数据差异显著,即t检验中P<0.05。

2 结果与分析

2.1 小球藻的比生长速率

不同pH条件下BDE-85含量的比生长速率见图1。在4种pH梯度(8.66、8.44、8.19、7.93)下,3.04 μg/g和6.08 μg/g试验组的比生长速率相较于对照组均明显升高,经单因素方差分析,可知每个pH条件下的6.08 μg/g试验组与其对照组间差异显著(P<0.05),分别高出对照组22.87%、9.29%、18.94%、19.77%;pH 8.66、pH 8.44和pH 7.93这3个梯度的24.32 μg/g试验组和对照组之间差异显著(P<0.05),比对照组分别低39.06%、30.45%、14.93%;在4种pH梯度下,24.32 μg/g试验组的比生长速率始终处于较对照组小的趋势,说明BDE-85含量过高,对小球藻的生长产生明显抑制作用;当pH为8.19时,只有6.08 μg/g试验组的比生长速率相较于对照组有显著差异(P<0.05),促进小球藻的生长,24.32 μg/g试验组的比生长速率较对照组低15.83%;pH 7.93时的多个含量BDE-85处理组比生长速率较pH 8.19时普遍偏高。分析认为,酸化条件促进海水小球藻生长的同时,也在一定程度上抑制了BDE-85的致毒胁迫效应。结论与净光合放氧速率和暗呼吸速率的结果相符合(待发表)。

图1 不同pH和BDE-85含量下小球藻的比生长速率Fig.1 Specific growth rate of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH不同字母表示差异显著(P<0.05),下同.Different superscipts represent significant differences (P<0.05), et sequentia.

2.2 小球藻的净光合放氧速率和暗呼吸速率

不同pH条件下6组含量BDE-85的净光合放氧速率和暗呼吸速率见图2和图3。试验结果表明,相较于pH 8.19时,其他3个pH条件下的净光合放氧速率均明显呈现上升趋势,特别是pH 7.93时的净光合放氧速率,在6个BDE-85含量组中分别比pH 8.19时高出283.33%、136.65%、594.98%、1879.35%、535.16%、1585.23%;而暗呼吸速率则呈下降趋势,与pH 8.19时相比,pH 7.93各组中除对照组高出23.9%,其他5组分别降低46.57%、66.95%、12.32%、31.28%、43.15%。这表明低pH条件增强了对照组的暗呼吸速率和净光合放氧速率。海水小球藻有机物的积累增加,且这个过程中所消耗的能量也随之增加,总体上呈现出比生长速率上升趋势,但BDE-85的加入使暗呼吸速率下降的同时,净光合放氧速率上升,这种相反的趋势表现出有机污染物的毒性在某种程度上被低pH条件减轻,生长加速,特别是6.08 μg/g试验组存在显著性差异。在pH 7.93条件下的组间的单因素方差分析中,6.08 μg/g试验组的净光合放速率与其他组均差异显著(P<0.05),其暗呼吸速率与3.04、12.16、24.32 μg/g试验组存在显著差异,6.08 μg/g试验组在低pH条件水平下净光合放氧速率比对照组高出18.43%,24.32 μg/g试验组则比对照组低39.98%。结合其比生长速率可以得出,在低pH条件下及本试验设置的6种BDE-85含量梯度中,BDE-85含量为6.08 μg/g时对小球藻的缓解毒性效果最强。在低pH条件下的24.32 μg/g试验组中,净光合放氧速率和暗呼吸速率相较于对照组均存在显著性差异,呈下降趋势,推测原因是毒性过高使藻细胞受损,细胞活力减弱。

2.3 小球藻叶绿素荧光参数

4个不同pH条件下BDE-85含量的叶绿素荧光参数见表1。4个pH条件下均出现了光抑制作用,24.32 μg/g试验组较其他5组的光抑制作用更明显,α、Ik、rETRmax参数值波动较大。pH 8.44和pH 8.19时的α、Ik、rETRmax参数值不存在显著性差异。由表1可见,比较对应BDE-85含量梯度的rETRmax参数值,pH 7.93时各BDE-85含量的rETRmax比pH 8.19时的rETRmax分别高出57.17%、64.30%、56.90%、46.71%、57.14%和66.30%。pH 7.93时的rETRmax偏高表明光系统Ⅱ的效率更高,光合作用增强,BDE-85的致毒效应被低pH条件缓解,但在低pH条件下,高含量24.32 μg/g试验组与对照组相比受光抑制作用更加明显,这也反映出高含量BDE-85对藻细胞光合系统稳定性产生一定的损害作用。

表1 不同pH和BDE-85含量下小球藻的叶绿素荧光参数Tab.1 Chlorophyll fluorescence parameters of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH

2.4 小球藻的过氧化氢酶活性

在4个不同pH条件下,6个BDE-85含量组的过氧化氢酶活性变化趋势见图4。除pH 8.44条件下,其他3个pH条件下小球藻的过氧化氢酶活性在连续3 d的检测中整体均呈上升趋势,pH 8.66时3 d的上升趋势显著(P<0.05)。pH 8.19时,6.08 μg/g试验组和24.32 μg/g试验组与对照组相比差异显著(P<0.05),pH 7.93时也存在相同结果,表明中含量6.08 μg/g及以上的BDE-85均能显著刺激藻细胞产生应激反应,以抵抗BDE-85的损伤胁迫。同时pH 8.19条件下和pH 7.93条件下对比可知,连续3 d测定后者6.08 μg/g试验组的过氧化氢酶活性比前者分别降低42.82%、36.81%和27.30%,说明低pH条件在该含量下显著地缓解了BDE-85对藻细胞的毒害作用。试验证实,24 h和48 h时藻细胞可能处于诱导激活酶活的反应过程,而且在低pH条件下,中、低含量的BDE-85的毒性可以被不同程度的缓解,24.32 μg/g试验组的被缓解效果不佳,应该归因于BDE-85含量太高,对藻细胞的损伤过强已经难以通过低pH条件缓解。

图4 不同pH和BDE-85含量下小球藻的过氧化氢酶活性Fig.4 Catalase activity of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH

2.5 小球藻的超氧化物歧化酶活性

4个pH条件下6个BDE-85含量组的小球藻超氧化物歧化酶活性变化趋势见图5。整体来看,随着培养时间的增加,4个pH条件下的海水小球藻超氧化物歧化酶活性均表现出先升后降的趋势。4个pH条件下的48 h和72 h时,6.08 μg/g试验组的超氧化物歧化酶活性始终维持最高,与多个组存在显著性差异(P<0.05),其中48 h时,6.08 μg/g试验组相较对照组分别高出76.05%、37.59%、20.90%和39.45%,其在整体趋势中超氧化物歧化酶活性最高。pH 8.19和pH 7.93条件下相比,后者整体活性比前者要高约10%,表明低pH条件促进了藻细胞产生超氧化物歧化酶,从而激活抗氧化系统清除氧自由基,以对抗BDE-85的毒性。但随着时间的增加,BDE-85对藻细胞的超氧化物歧化酶调节系统应该存在某种程度的损伤,特别是4个pH条件下高含量24.32 μg/g试验组与对照组相比分别降低了23.52%、29.29%、29.46%和16.35%,说明高含量BDE-85对藻细胞的损伤更严重。pH 7.93条件下的24.32 μg/g试验组的超氧化物歧化酶活性在72 h呈现下降趋势,并且超氧化物歧化酶活性始终不如6.08 μg/g试验组的高,但二者的超氧化物歧化酶活性均显示增强,分析认为,BDE-85和低pH条件的耦联对超氧化物歧化酶的生理调节机制受BDE-85含量的影响较小。

图5 不同pH和BDE-85含量下小球藻的超氧化物歧化酶活性Fig.5 Superoxide dismutase activity of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH

3 讨 论

3.1 不同pH条件下五溴联苯醚BDE-85对小球藻光合特性的影响

高坤山[24]指出,藻类的二氧化碳浓缩机制(CCMs)会受到环境酸化的影响而下调,因此藻细胞获得的光能量增多,这有利于增强光合作用,增加有机物的积累和细胞活力从而抵抗BDE-85的毒害作用。酸化条件下的海水小球藻的最大电子传递速率较对照组显著性增加,但光抑制现象也同样加剧,二氧化碳浓缩机制会使酸化条件下的小球藻更易受到高光胁迫,而高含量的BDE-85加剧了光抑制效应。在低pH条件下及设置的6种含量梯度中,BDE-85含量为6.08 μg/g时对小球藻的缓解毒性效果最强,高含量24.32 μg/g试验组中,净光合放氧速率和暗呼吸速率相较于对照组均存在显著差异,呈下降趋势。笔者认为,是由BDE-85含量过高、毒性过强使藻细胞受损严重,细胞活力严重减弱所致。pH 7.93 时各BDE-85含量相对应的最大电子传递速率普遍高于pH 8.16、8.66时,而pH 7.93时的最大相对电子传递速率偏高表明光系统Ⅱ的效率更高,说明光合作用增强,BDE-85的致毒效应被酸化缓解;但在低pH条件下,高含量24.32 μg/g试验组与对照组相比,受光抑制作用更加明显,这也反映出高含量BDE-85对藻细胞的光合系统的稳定性产生了一定的损害。试验结果表明,低pH条件促进了小球藻生长的同时也在一定程度上缓解了BDE-85的毒性效应,小球藻的比生长速率、净光合放氧速率和暗呼吸速率以及最大电子传递速率的结果均能验证,但当BDE-85含量过高时,低pH条件的缓解效果弱于毒害作用。

3.2 不同pH条件下BDE-85对小球藻抗氧化系统的影响

高坤山[24]提到,酸化会影响藻类的生理调节机制、膜的氧化还原作用及其离子透过性。本试验结果表明,低pH条件能显著缓解BDE-85对藻细胞的毒害作用。试验证实,24 h和48 h时藻细胞可能处于诱导激活酶活的反应阶段,而且在低pH条件下,中、低含量BDE-85的毒性可以被不同程度的缓解,24.32 μg/g试验组的被缓解效果不佳,应该归因于BDE-85含量太高,对藻细胞的损伤过强已经难以通过低pH条件缓解。李卓娜等[25]研究发现,BDE-49对多种微藻的抗氧化特性、光合特性有影响,BDE-49对海洋微藻具有毒性,并且验证了微藻的叶绿素荧光参数、电子传递速率和过氧化物酶活性等是判定BDE-49污染水平的标志性依据。本试验结果显示,低pH条件和高含量BDE-85的耦联对过氧化氢酶的生理调节机制影响显著,而BDE-85和低pH条件的耦联对超氧化物歧化酶的生理调节机制受BDE-85含量的影响较小。笔者仅做了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶两种酶活性的检测,可能具有一定的局限性,还需进一步研究探讨。

笔者仅对单一藻种和单种多溴联苯醚污染物进行了致毒胁迫效应的测定,下一步可以深入研究多种多溴联苯醚污染物对某一种藻的致毒胁迫效应,从而模拟海水中的藻类生长状况,为多溴联苯醚污染的防治与管控提供理论依据。

4 结 论

(1)不同pH条件下,中、低含量的BDE-85对小球藻的生长有一定的促进作用,高含量的BDE-85对小球藻的生长有显著抑制作用。

(2)低pH条件使经过中、低含量BDE-85处理的小球藻的抗氧化作用和光合作用增强,在一定程度上缓解了BDE-85的细胞毒性,稳定并促进小球藻的生长,但在高含量的BDE-85处理中,二者交互作用不明显。