14个克氏原螯虾养殖群体遗传多样性分析

刘小宇,熊礼静,彭 波,罗翠荣,蓬国辉,朱 玺,白旭峰,4,5

( 1.华中农业大学 双水双绿研究院,作物遗传改良全国重点实验室,湖北 武汉 430070; 2.华中农业大学 水产学院,湖北 武汉 430070; 3.华中农业大学 生命科学技术学院,湖北 武汉 430070; 4.湖北洪山实验室,湖北 武汉 430070; 5.长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心,湖北 武汉 430070 )

克氏原螯虾(Procambarusclarkii),俗称小龙虾,属节肢动物门甲壳纲十足目螯虾科原螯虾属[1],在我国属于入侵物种[2-3]。该物种原产于美国南部和墨西哥北部[4],于20世纪30年代由日本传入我国南京地区[5]。由于克氏原螯虾具有较强的繁殖能力,且适应环境能力强,其已扩张至包括整个长江流域的20多个省、市、自治区[5]。20世纪90年代,我国开始养殖克氏原螯虾[6]。随着人们消费需求的不断增加,克氏原螯虾的养殖规模逐年上升。据统计,2019年,我国克氏原螯虾养殖总产量达208.96万t,养殖总面积达129万hm2,其产业总产值达4110亿元[7]。

优质种苗是实现克氏原螯虾养殖效益增值的关键,但养殖户捕大留小、逆向选择,以及自繁自育的种苗繁育模式导致其种质严重退化。易感病、生长变缓、成虾个体变小已成为阻碍克氏原螯虾养殖产量增加与规格品质提升的主要因素,遗传改良克氏原螯虾种苗迫在眉睫。种质资源遗传多样性的高低在一定程度上决定选育潜力,克氏原螯虾群体的遗传多样性及遗传结构评估可为其遗传育种方案制定提供参考依据。已有研究显示,入侵群体的遗传多样性常小于原产地群体的遗传多样性,但它们也具有相对较高的遗传多样性[8-11]。Barbaresi等[12]报道,入侵欧洲的克氏原螯虾群体具有较高的遗传变异。李喜莲等[13]研究的我国8个克氏原螯虾野生群体的遗传多样性也较高,且存在一定的遗传分化。然而,我国克氏原螯虾养殖群体自繁自育导致遗传多样性降低,加之不同养殖区域的种苗被相互引种,进一步加剧了种苗的同质化。截至目前,我国克氏原螯虾养殖群体遗传多样性及其同质化程度等鲜有报道。为此,笔者通过收集与分析我国克氏原螯虾养殖群体的遗传多样性与群体结构,以期了解这些种质资源的现状,并评估其育种应用价值。

1 材料与方法

1.1 样品采集

表1 克氏原螯虾群体采集地点与样本量Tab.1 Collection locations and sample size of the red swamp crayfish P. clarkii population

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

取约50 mg克氏原螯虾尾肌肉于1.5 mL离心管中,充分剪碎后采用苯酚-氯仿法[5]提取基因组DNA,加入200 μL超纯水溶解DNA,经琼脂糖凝胶电泳检测合格后,置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 PCR扩增

将制备好的基因组DNA转移至96孔PCR板中,分别用文献[14]中的35个SSR标记(PCM108、PCM155、PCM158、PCM363、PCM364、PCM394、PCM409、PCM412、PCM414、PCM564、PCM588、PCM628、PCM646、PCM806、PCM858、PCM887、PCM898、PCM1033、PCM1299、PCM1639、PCM1673、PCM1733、PCM1790、PCM1846、PCM1867、PCM1966、PCM2012、PCM2017、PCM2062、PCM2096、PCM2116、PCM2275、PCM2318、PCM2344与PCM2370)进行PCR扩增。

反应体系:10×Buffer 4 μL、dNTP 1 μL、r-Taq酶0.15 μL 、引物2 μL、DNA模板2 μL、加超纯水至20 μL。反应程序:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃延伸7 min。产物降温至25 ℃后,加入2 μL溴酚蓝混匀后,用琼脂糖凝胶(1%)电泳检测扩增效果。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

用4%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物,阅读各标记电泳条带并统计分析。

1.2.4 遗传统计分析

收集14个群体的微卫星分子标记基因型数据,利用POPGENE 3.2软件[15]对等位基因数、期望杂合度、观测杂合度、多态性信息含量、哈迪-温伯格平衡、遗传距离等进行分析。运用Structure 2.3.4软件分析14个群体的群体结构,预热次数为100 000,随后进行1 000 000次重复计算[16]。利用MEGA 7.0软件构建非加权组平均法系统进化树[17]。利用在线软件Structure Harvester[18](http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/)计算ΔK得出遗传群体数目K。

选用50%抗蚜威可湿性粉剂1500倍液～1600倍液，或10%吡虫啉可湿性粉剂2500倍液，或2.5%三氟氯氰菊酯乳油1500倍液～2000倍液喷雾防治，药剂交替使用，隔7d～10d防治1次，防治1次或2次，收获前5d～7d停止用药。

2 结 果

2.1 不同地域群体微卫星分子标记基因型分析

各标记的PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(图1)后,再将其产物片段按大小依次定义为“A”、“B”、“C”等位基因,最后统计基因型。基因型频率大于0.3的基因型被定义为群体的主要基因型。所选用的标记在14个群体中的等位基因数为2～3,其中标记PCM158、PCM364、PCM588、PCM898、PCM1639、PCM1846、PCM2116与PCM2344有3个等位基因,其余标记均为2个等位基因(表2)。在所有检测到的主要基因型(434个)中,纯合子(279个)约占64.28%,表明各群体处于一定程度的杂合子缺失状态。

图1 PCM1673、PCM2116与PCM2318标记PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.1 Polyacrylamide gel electrophoresis of PCR products of makers of PCM1673, PCM2116 and PCM2318

表2 35个微卫星分子标记在14个克氏原螯虾群体中的主要基因型Tab.2 Main genotypes of the 35 SSR markers in the 14 populations of red swamp crayfish P. clarkii

2.2 不同地域群体遗传多样性分析

对各群体的平均杂合度进行分析得出,采集的14个群体的平均多态信息含量为0.33～0.43(表3)。当多态信息含量>0.5时即为具有高多态性,而0.25<多态信息含量<0.5时,则视为具有中度多态性,由此可见,本研究的14个群体均只具有中度多态性。各地域群体的平均观测杂合度与平均期望杂合度分别为0.32～0.41和0.36～0.44。其中,递铺、龙南群体的平均期望杂合度最小(0.36),衢州群体平均期望杂合度最大(0.44)。除温州群体外,其他13个群体的平均观测杂合度均小于平均期望杂合度。总之,本研究的14个养殖群体具有中等遗传多样性,其中递铺和龙南群体的遗传变异相对较小。

表3 35个微卫星分子标记在14个克氏原螯虾群体中的平均多态信息含量与平均杂合度(平均值±标准差)Tab.3 Mean polymorphism information content and heterozygosity of the 35 SSR markers in the 14 populations of red swamp crayfish P. clarkii (Mean±SD)

2.3 不同地域群体哈迪-温伯格平衡分析

分别对14个群体的35个微卫星分子标记位点进行哈迪-温伯格平衡分析,其结果显示:除了香树坝和椿木营群体外,其余12个群体均在多个标记(≥5)位点存在基因型分布偏离哈迪-温伯格平衡现象(P<0.05)(表4),推测该不平衡是由杂合子缺失所致。

表4 哈迪-温伯格平衡检验Tab.4 Hardy-Weinberg equilibrium test

2.4 不同地域群体遗传距离分析

14个群体的遗传距离分析结果表明,各地域群体的遗传距离为0.03～0.15,遗传距离越大表示亲缘关系越远(表5)。新余和临江及莲花池的遗传距离分别为0.03,亲缘关系最近。武汉和递铺的遗传距离为0.15,亲缘关系最远。基于Nei′s遗传距离对14个群体构建的非加权组平均法系统发育树见图2。14个群体大致可聚为4个类群,香树坝、温州、衢州群体和吉安、天荒坪、递铺群体分别聚为2个类群,龙南单独为1个类群,其余群体为1个类群。由此可见,多数地理位置较近的群体往往聚为同一类群。

表5 14个克氏原螯虾群体的遗传距离Tab.5 Genetic distance of the 14 populations of red swamp crayfish P. clarkii

图2 14个克氏原螯虾群体非加权组平均法系统发育树Fig.2 UPGMA phylogenetic tree of the 14 populations of red swamp crayfish P. clarkii

2.5 不同地域群体的遗传结构分析

利用Structure软件与在线软件Structure Harvester对14个群体的遗传结构分析得出,K=4(图3a),表明本研究的14个克氏原螯虾群体可分为4个遗传群体。吉安、天荒坪、递铺群体(1～3)的遗传结构较为相似,此外,温州、衢州、香树坝与武汉群体(5～8)的遗传结构也较为相似,但前者(1～3)的遗传结构明显不同于后者(5～8),为此,它们可被视为2个不同的遗传群体(图3b)。同理,龙南群体(4)和其余6个群体(9～14)属于另外2个不同的遗传群体。

图3 14个克氏原螯虾群体的群体结构分析Fig.3 Population structure analysis of the 14 populations of red swamp crayfish P. clarkiia.ΔK评估值;b.当K=3、4、5时,14个克氏原螯虾群体的结构图,1～14分别表示吉安、天荒坪、递铺、龙南、温州、衢州、香树坝、武汉、新余、临江、莲花池、椿木营、阳新与修水群体.a.the assessed values of Delta K; b.population structure map of the 14 populations of red swamp crayfish at K=3, 4, and 5; the populations of Jian, Tianhuangping, Dipu, Longnan, Wenzhou, Quzhou, Xiangshuba, Wuhan, Xinyu, Linjiang, Lianhuachi, Chunmuying, Yangxin and Xiushui are represented by the number from 1 to 14, respectively.

3 讨 论

3.1 克氏原螯虾野生群体遗传多样性大于养殖群体

本研究结果显示,我国14个地区的克氏原螯虾养殖群体的平均多态信息含量为0.33～0.43、平均观测杂合度与平均期望杂合度分别为0.32～0.41、0.36～0.44,表明这14个克氏原螯虾养殖群体具有中度的遗传多样性。目前,关于我国克氏原螯虾养殖群体遗传多样性鲜有报道。黄小芳等[19]探究过广西5个地区(南宁、大塘、融水、柳州和来宾)的克氏原螯虾养殖群体的遗传多样性,其结果显示,在检测群体中,各标记位点的有效等位基因数、平均期望杂合度与平均多态信息含量分别为2.5142～3.0574、0.5708～0.6489与0.4899～0.5843,表明被检测群体具有中度或高度的遗传多样性。与本研究的14个养殖群体相比,上述广西的5个养殖群体遗传多样性较高。由此推测:广西并非克氏原螯虾的主养区,种苗主要来源于捕捞野生群体;而本研究的群体大多数来自于克氏原螯虾的主养区(湖北与江西),其种苗已自繁自育多代,导致近交使其遗传多样性降低。相反,克氏原螯虾野生群体的遗传多样性研究报道较多,如:曹玲亮[20]报道,长江、新安江、淮河3大流域9个地域的野生群体的平均期望杂合度和平均观测杂合度分别为0.779与0.360;邢智珺[21]研究结果显示,江苏9个克氏原螯虾野生群体的平均观测杂合度为0.556,平均期望杂合度为0.745,多态信息含量为0.509～0.875;谭云飞等[22]报道,长江中下游13个地域野生群体的平均期望杂合度、平均观测杂合度与多态性信息含量分别为0.37～0.57、0.23～0.48与0.40～0.56。这些研究结果表明,我国各地域克氏原螯虾野生群体具有中度到高度的遗传多样性。而本研究采集的克氏原螯虾养殖群体的遗传多样性明显低于野生群体的遗传多样性,这一结论也与已有研究相似[23]。

3.2 不同地域的克氏原螯虾养殖群体趋于同质化

本研究的14个养殖群体的遗传距离为0.03～0.15,与曹玲亮[20]研究的长江、新安江、淮河3大流域9个地域的野生群体的遗传距离(0.06～0.18)较为相近,但低于邢智珺[21]研究的群体(0.071～0.611)与李喜莲等[13]研究的群体(0.010～0.412)。理论上,由于地理隔离,不同地域的克氏原螯虾群体会存在一定的遗传分化,但本研究结果却与其并不相符。推测其原因有二:首先,养殖群体的种苗多为人为引种,致使不同地域群体间的基因流动增加,进而使它们的种质趋于同质化;其次,养殖群体的种苗基本为自繁自育,近交严重,导致它们的遗传多样性降低,杂合子缺失。这也与本研究中的多数微卫星标记位点基因型存在偏离哈迪-温伯格平衡的结果相吻合。

3.3 克氏原螯虾种质现状与展望

当前,我国克氏原螯虾产业规模大,具有较强的发展潜力。然而,在克氏原螯虾养殖中,优良种苗缺乏严重制约了其产业的持续发展。本研究结果显示我国14个克氏原螯虾养殖群体的遗传多样性明显低于野生群体,且同质化愈发严重。丰富的种质资源是良种培育的关键,虽然野生克氏原螯虾遗传多样性相对丰富,但是野生克氏原螯虾种质资源被过度捕捞、对其种质资源多样性造成了严重威胁。为此,建立我国野生克氏原螯虾种质资源保护区,构建其核心种质资源库,加快克氏原螯虾优良品种培育,提高种苗繁育技术水平,将对其产业的持续发展具有重要的意义。

4 结 论

本研究中的14个克氏原螯虾养殖群体具有中度遗传多样性,各标记位点均存在杂合子缺失,经过遗传距离和群体结构分析,可将采集的群体分为4个遗传群体。