4种水产消毒剂对棘胸蛙蝌蚪急性毒性研究

谢永广,魏朝宇,魏秀英,罗华辉,陈敦学

( 贵州大学 动物科学学院,贵州大学渔业资源与环境研究中心,贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,贵州 贵阳 550025 )

作为重要的水产养殖品种,目前两栖类养殖规模日益扩大,水产消毒剂的使用已不可避免。为确保水产消毒剂仅具有消毒效果,而对养殖水产动物和自然环境呈低毒或无毒作用,首先应该优化消毒剂的使用剂量[1]。蝌蚪长期生活在水中,其鳃和皮肤具有较好的渗透性,对药物较为敏感[2],利用蝌蚪进行急性毒性试验已经成为一种标准方法[3]。目前对蝌蚪的急性毒性试验主要集中在重金属类,如评价Cu2+和Cd2+对中华蟾蜍(Bufogargarizans)[4-5]、泽陆蛙(Fejervaryamultistriata)[6]、海陆蛙(F.cancrivora)[7]的影响,以及Cr6+对中国林蛙(Ranachensinensis)的急性毒性试验等[8]。

关于氯化钠、甲醛、高锰酸钾、聚维酮碘等常见水产消毒剂对两栖类急性毒性的研究尚较少。目前仅有:程剑等[9]分析了4种消毒剂对黑斑蛙(R.nigromaculata)毒性的影响,认为黑斑蛙蝌蚪对高锰酸钾敏感性最强,而除氯化钠属于低毒性消毒剂外,硫酸铜、高锰酸钾、聚维酮碘等均属于中毒性消毒剂,使用过程中要控制好用量;梁成斌等[10]分析了高锰酸钾和氯化钠对东北林蛙(R.dybowskii)蝌蚪的急性毒性影响;Langhans等[11]研究表明,氯化钠质量浓度为5600 mg/L时,东北林蛙蝌蚪大量死亡;Santana等[12]发现,甲醛对牛蛙(Lithobatescatesbeianus)蝌蚪的96 h半致死质量浓度为10.53 mg/L。

不同种类蝌蚪在生物学特性上的种属差异导致对化学品的敏感性也存在差异[12],因此实际操作中,一般依托本地两栖类模式生物进行研究,棘胸蛙(Quasipaaspinosa)作为我国特有的一种大型食用蛙类,主要分布在我国南方八省,具有良好的养殖前景,目前养殖规模不断扩大,从业人数较多。同时,棘胸蛙对生存环境要求苛刻,被称为生态环境的晴雨表,对环境变化非常敏感,是进行急性毒性试验的优质材料[13]。因此,笔者以棘胸蛙蝌蚪为试验材料,采用水生生物急性毒性试验方法,研究4种常见水产消毒剂氯化钠、甲醛、高锰酸钾和聚维酮碘对其的急性毒性作用,以期为棘胸蛙的规范养殖和安全用药提供依据,并为常用水产消毒剂对两栖类急性毒性的评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用棘胸蛙蝌蚪采自贵州省黔东南州台江县,试验前将蝌蚪培养至38～39期(Gosner分期[11]),约50日龄,在室内养殖池暂养7 d后,选出规格相近、活动性好的健康蝌蚪进行毒性试验。试验蝌蚪的平均体质量为(0.79±0.22) g,平均体长(吻端至尾端)为(43.00±0.81) mm。试验用水为充分曝气3 d以上的自来水,水温(20±1) ℃、pH 7.2、溶解氧≥5.5 mg/L,自然光周期条件下培养。

试验所用试剂氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)、甲醛(国药集团化学试剂有限公司)和高锰酸钾(广东航鑫科技股份公司)均为分析纯,聚维酮碘(PVP-I)(湖北五湖渔业股份有限公司)有效含量≥99%,有效碘含量为10%。并按照使用说明采用双蒸水配制成母液,试验时稀释到使用质量浓度即可。

1.2 试验方法

通过预试验确定棘胸蛙蝌蚪24 h致死质量浓度下限值及96 h无死亡质量浓度上限值,确定正式试验的药物质量浓度。开始试验时,氯化钠、甲醛、高锰酸钾、聚维酮碘4种药物按等对数间距分别设置5个质量浓度组,同时再设定1个空白对照组。4种药物的质量浓度梯度见表1。每个试验容器中有药液10 L,每个质量浓度处理随机放置20尾蝌蚪,并设置3个平行。采取静态-更新的方法[14],每12 h换水50%,并加入不同质量浓度的相应药物,试验前1 d及试验期间禁食[15]。试验开始后的前8 h连续观察供试蝌蚪的中毒症状,然后每隔12 h为时间点,观察记录蝌蚪在24、48、72、96 h死亡的数量,并及时清除死亡个体。判断蝌蚪死亡的标准是用镊子轻夹蝌蚪尾部,连续观察30 s,若蝌蚪无反应,即认为蝌蚪已死亡[15]。

表1 4种水产消毒剂的试验质量浓度Tab.1 Concentrations of four aquaculture disinfectants in the experiment

1.3 数据处理

采用改良寇式法计算各试验组的半致死质量浓度(LC50)及其95%置信区间,并以试验质量浓度的对数为横坐标、死亡率为纵坐标做直线回归方程。药物毒性蓄积程度系数参照文献[9]方法计算,安全质量浓度(SC)按下式计算:

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

2 结 果

2.1 蝌蚪中毒症状描述

随着消毒剂质量浓度增加,蝌蚪中毒症状逐渐明显,高质量浓度氯化钠处理后,蝌蚪反应剧烈,在水里狂游不止,并随着作用时间延长,蝌蚪开始出现身体侧翻或尾末端不自然弯曲,皮肤变暗,且死亡个体均呈现尾梢上翘症状;甲醛和高锰酸钾处理后,蝌蚪死亡后体表黏液明显增多;而聚维酮碘处理蝌蚪后,蝌蚪游动加快、反应剧烈,并不时出现身体颤抖,随后便死亡,且随着药物质量浓度增加和作用时间延长,蝌蚪的致死效应加剧。

2.2 急性毒性特征分析

试验期间,对照组棘胸蛙蝌蚪表现正常,无死亡现象;试验组中,随药物质量浓度的增加和作用时间的延长,蝌蚪死亡率逐渐上升(表2)。氯化钠质量浓度为8659.28 mg/L时,48 h蝌蚪死亡率超过50%[(57.67±0.94)%];当质量浓度为15 000 mg/L时,蝌蚪在48 h时即全部死亡。甲醛质量浓度达到10 mg/L时,蝌蚪72 h开始出现死亡,死亡率为(6.67 ± 0.47)%;质量浓度为22.36 mg/L时,72 h的死亡率超过50%[(56.67±1.25)%];质量浓度为50 mg/L时,48 h即全部死亡。高锰酸钾质量浓度为2 mg/L时,96 h开始出现死亡;质量浓度为4.47 mg/L时,72 h死亡率超过50%[(55.00±0.82)%];质量浓度为10.00 mg/L时,48 h即全部死亡。聚维酮碘质量浓度为3.74 mg/L时,72 h的死亡率超过50% [(50.00±2.45)%];质量浓度为7.00 mg/L时,24 h即全部死亡。

表2 4种水产消毒剂对棘胸蛙蝌蚪的致死率Tab.2 The mortality of frog Q. spinosa tadpoles exposed to four aquaculture disinfectants

2.3 半致死质量浓度和毒性蓄积效应

氯化钠、甲醛、高锰酸钾和聚维酮碘对棘胸蛙蝌蚪半致死质量浓度和毒性蓄积效应见表3。半致死质量浓度随作用时间的延长所需消毒剂质量浓度逐渐下降,其中4种消毒剂24、48、72、96 h的半致死质量浓度排列均为:氯化钠>甲醛>高锰酸钾>聚维酮碘。氯化钠、甲醛、高锰酸钾、聚维酮碘4种药物对棘胸蛙蝌蚪96 h的半致死质量浓度分别为7145.53、16.32、3.61、2.93 mg/L。依据安全质量浓度计算方法,得到4种消毒剂安全质量浓度分别为1949.01、4.80、0.88、1.85 mg/L。药物毒性蓄积程度系数呈现较大的差异,其中氯化钠和甲醛处理组随着作用时间延长,药物毒性蓄积程度系数呈下降趋势,且氯化钠处理下降较快,药物蓄积效应差,而高锰酸钾和聚维酮碘处理组的药物毒性蓄积程度系数在96 h内呈现先降后升的现象。通过回归分析得到棘胸蛙蝌蚪死亡率(y)与消毒剂质量浓度对数(x)的回归方程(表4),所有回归方程均呈上升趋势,说明随着药物作用时间的延长,死亡率会逐渐上升。

表3 4种消毒剂对棘胸蛙蝌蚪急性毒性特征分析Tab.3 Acute toxicity characteristics of four aquaculture disinfectants for frog Q. spinosa tadpoles

表4 4种水产消毒剂对棘胸蛙蝌蚪毒性的回归分析Tab.4 Regression equations of four aquaculture disinfectants for frog Q. spinosa tadpoles

3 讨 论

3.1 棘胸蛙蝌蚪消毒剂敏感性分析

目前利用本土两栖类作为化学品毒性的生物测试方法已成为共识[3],如苏红巧等[16]建立了利用蝌蚪进行急性毒性试验标准。然而我国本土的两栖类种类较多,包括黑斑蛙[10]、海陆蛙[7]、中华蟾蜍[5]、棘胸蛙[13]等,且不同的物种存在生物学上的种属特异性,对化学品的敏感性也存在差异。随着我国生态文明建设的进一步深入,选择一种对化学品敏感且容易获得的本土蛙类进行相关急性毒性试验,对进行生态环境监测具有重要意义。本试验中的棘胸蛙蝌蚪对聚维酮碘的敏感性远远高于黑斑蛙[9];对高锰酸钾的敏感性略低于黑斑蛙[9]和东北林蛙[10];对氯化钠的敏感性与黑斑蛙[9]基本相同,而高于东北林蛙[11];对甲醛的敏感性低于东北林蛙[11]和牛蛙[12],但高于黄尾鲴(Xenocyprisdavidi)[17]和花鳗鲡(Anguillamarmorata)幼鱼[18]。以上结果说明棘胸蛙蝌蚪可以作为环境毒性的监测生物。此外,高锰酸钾的使用具有温度依赖性[19-20],在实际生产中养殖户很难把握合适的使用剂量,因此建议使用聚维酮碘作为消毒剂。

3.2 4种消毒剂的毒性特征与用药安全

正确合理地使用消毒剂可以有效控制许多细菌、寄生虫和真菌的暴发,减少抗生素的使用。半致死质量浓度是评价药物对水产动物急性毒性的重要指标,试验结果显示,氯化钠和甲醛对棘胸蛙蝌蚪的96 h半致死质量浓度分别为7145.53、16.32 mg/L,大于10.0 mg/L,属于低毒消毒剂;高锰酸钾和聚维酮碘的96 h半致死质量浓度分别为3.61、2.91 mg/L,介于1.0～10.0 mg/L内,属于中毒消毒剂[21]。类似的结果在其他蛙类中也有报道,如:高锰酸钾对东北林蛙蝌蚪[10]和黑斑蛙蝌蚪[9]的96 h半致死质量浓度分别为1.098、1.803 mg/L,远低于一般养殖鱼类[18,22];甲醛对牛蛙蝌蚪[12]的96 h半致死质量浓度分别为16.32、10.53 mg /L,远低于花鳗鲡幼鱼(88.78 mg/L)[18]和黄尾鲴(72.30 mg/L)[17];氯化钠对黑斑蛙蝌蚪[9]的96 h半致死质量浓度为7348.56 mg/L,同时在氯化钠质量浓度为5600 mg/L时,东北林蛙[11]出现大量死亡,均低于黄尾鲴(9664.36 mg/L)[17]、西杂鲟幼鱼(8.17 mg/L)[23]和花鳗鲡幼鱼(22 278 mg/L)[18]的96 h半致死质量浓度。由此推断,两栖类蝌蚪对消毒剂的敏感性通常高于鱼类,利用两栖类检测环境中的微量毒物及环境污染情况,具有重要的应用价值和参考作用。

本试验中,高锰酸钾对棘胸蛙蝌蚪的安全质量浓度为0.88 mg/L,高于黑斑蛙[9]的0.27 mg/L,也高于东北林蛙[10]的0.534 mg/L,然而却远低于生产使用量10 mg/L,同时已有研究证明,高锰酸钾的消毒效果不存在剂量依耐性[1],因此如采用高锰酸钾作为消毒剂,建议通过降低使用剂量和延长消毒时间的方式进行。聚维酮碘对棘胸蛙蝌蚪的安全质量浓度为1.85 mg/L,低于黑斑蛙蝌蚪[9]的安全质量浓度2.71 mg/L,也低于西杂鲟幼鱼[23]的安全质量浓度2.37 mg/L,甚至低于生产上使用的剂量2～4 mg/L,因此在棘胸蛙蝌蚪养殖过程中,使用聚维酮碘作为消毒剂时使用要减少用量,以免造成损失。氯化钠对棘胸蛙蝌蚪安全质量浓度为1949.01 mg/L,低于黑斑蛙[9]的安全质量浓度2204.6 mg/L,通常生产上仅用氯化钠下塘前浸泡消毒苗种,而少用于水体泼洒。甲醛对棘胸蛙蝌蚪的安全质量浓度为4.8 mg/L,远低于常用消毒剂量30 mg/L,因此,使用甲醛作为消毒剂时应该严格控制其使用剂量,或者及时换水。综上,为发挥消毒剂最优消毒效果以及避免在养殖过程中对棘胸蛙等两栖类造成较大伤害,消毒剂的使用可选择减少剂量和适当延长消毒时间这种方式。

3.3 消毒剂的杀菌原理分析

高锰酸钾作为一种强效氧化剂,主要通过产生抑制性化合物和增强免疫反应来保护宿主[24]。过量的高锰酸钾通过改变鱼体表面微生物菌群的群落组成,将消灭对高锰酸钾较为敏感的革兰氏阴性菌,进而降低致病菌感染难度[1]。一些水产动物对高锰酸钾具有较好的降毒解毒能力,在48～72 h内,高锰酸钾的药物毒性蓄积程度系数下降一半以上,具有较低的药物蓄积效应。因此在高锰酸钾消毒后,只要鱼类没有死亡则可以很快恢复,如高锰酸钾处理斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)后使其鳃轻度肥大并产生海绵状增生,但是经过48 h治疗后,即可恢复正常[24]。氯化钠是比较安全的鱼类养殖常规消毒杀菌药物,通过改变机体的渗透压来杀灭一些寄生虫和病原微生物,对治疗鱼类的水霉病、寄生虫病和细菌性疾病有一定的效果,但是生产上主要用于鱼苗下塘消毒[25]。聚维酮碘与有机物相互作用后,将具有杀菌作用的游离碘还原为碘化物,因此聚维酮碘消毒效果具有剂量依耐性,Silas等[26]发现,通过连续多次添加较低剂量的聚维酮碘可以取得与较高剂量聚维酮碘相似的消毒效果,可以避免高剂量的聚维酮碘引起水产动物中毒。甲醛主要通过烷基化反应使菌体蛋白变性,进而起到杀菌作用,主要用于对硫酸铜等药物敏感的鱼类[17]。

4 结 论

在4种水产消毒剂中,氯化钠和甲醛属于低毒消毒剂,而高锰酸钾和聚维酮碘属于中毒消毒剂。充分考虑剂量敏感性和使用方便性,推荐使用聚维酮碘作为消毒剂。此外蝌蚪对消毒剂的敏感性通常高于鱼类,因此在棘胸蛙等两栖类养殖过程中,消毒剂的使用需要减少剂量。