鱼类巨噬细胞标记物的研究进展

丁祝进,崔虎军,谷昭天,赵晓恒,程汉良

( 1.江苏海洋大学 海洋科学与水产学院,江苏 连云港 222005; 2.江苏省海洋生物技术重点实验室,江苏 连云港 222005; 3.江苏省海洋生物资源与环境重点实验室,江苏省海洋生物产业技术协同创新中心,江苏 连云港 222005 )

鱼类的免疫系统由非特异性免疫和特异性免疫组成,包括免疫组织和器官、免疫细胞及免疫因子等。鱼类免疫细胞主要有两种类型:一类是淋巴细胞,主要参与特异性免疫应答;另一类是吞噬细胞,作为非特异性和特异性免疫系统的重要组成部分,在抵御病原体侵袭方面发挥着非常重要的作用。巨噬细胞是由单核细胞衍生而来的白细胞,主要是以固定或游离细胞的形态对细胞残片和病原体进行吞噬、杀伤及消化,并激活淋巴细胞等其他免疫细胞,以抵御病原体感染从而保护生物体。鱼类巨噬细胞可被不同刺激物诱导,分化成表型和功能具有显著性差异的M1型和M2型巨噬细胞,不同类型巨噬细胞具有特定的标记物,笔者将对鱼类巨噬细胞通用型、M1型和M2型标记物的相关研究进展进行综述,相关标记物见表1。

表1 部分已报道的鱼类巨噬细胞标记物Tab.1 Some of the fish macrophage markers reported

1 巨噬细胞的通用标记物

巨噬细胞是一种可塑性较高的免疫细胞,参与机体的多种免疫学功能。鱼类巨噬细胞在未分化前,具有多种典型的标记物,称为巨噬细胞的通用标记物,如巨噬细胞集落刺激因子受体蛋白等。通用标记物可介导巨噬细胞的多种免疫功能,并可用于鱼类巨噬细胞的分选与鉴定,具有重要的研究意义。

集落刺激因子(CSF)是一类能刺激多能造血干细胞和不同发育阶段造血祖细胞增殖分化,并在固定培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。研究显示,部分集落刺激因子可以动员中性粒细胞和巨噬细胞迁移、分化和增殖,并增强其吞噬功能,称为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,又称CSF-1),最初发现于血清、尿液等体液中,主要由单核-巨噬细胞、淋巴细胞等分泌产生。巨噬细胞集落刺激因子在促进单核巨噬细胞生存、增殖、分裂和骨、胚胎的形成等多方面起到重要作用[27]。草鱼巨噬细胞集落刺激因子与白细胞介素-4/13(IL-4/13)同源物可以协同促进巨噬细胞增殖[28]。金鱼体内注射巨噬细胞集落刺激因子可增加血液中循环单核细胞的数量,且在原代金鱼巨噬细胞培养中持续添加重组巨噬细胞集落刺激因子,可以稳定细胞状态并延长巨噬细胞的存活时间,并增强长期培养巨噬细胞的呼吸爆发活性[29]。金鱼巨噬细胞对巨噬细胞集落刺激因子表现出浓度依赖性的趋化反应及吞噬活性增强,但该效应在培养基中添加巨噬细胞集落刺激因子受体后受到抑制[30]。因此,鱼类巨噬细胞集落刺激因子在促进巨噬细胞增殖、维持巨噬细胞体外稳定培养、延长巨噬细胞存活时间、增强巨噬细胞免疫活性等方面都发挥着重要作用。

巨噬细胞集落刺激因子受体是巨噬细胞的通用标记物[1],属于生长因子受体家族,与巨噬细胞集落刺激因子结合后发生二聚化或多聚化,从而激活一系列信号转导过程,对巨噬细胞的生长、增殖和分化等具有重要作用。在正常情况下,巨噬细胞集落刺激因子受体以跨膜蛋白的形式分布于细胞膜上,巨噬细胞集落刺激因子与其受体结合发挥着多种生物学效应,可以延长成熟巨噬细胞的寿命,增强正常巨噬细胞的生物学功能,参与多种与非造血组织、器官、系统相关的生长和发育,并影响着与之相关的疾病发生[31]。

巨噬细胞集落刺激因子受体在多种鱼类中都已克隆、鉴定,并作为巨噬细胞标记物进行应用[32]。金头鲷巨噬细胞集落刺激因子受体mRNA基因虽然在鳃、肝脏、脾脏和头肾等不同免疫组织中均有表达,但其表达仅限于单核/巨噬细胞谱系,且其表达可能受巨噬细胞激活阶段的影响[2]。金鱼巨噬细胞集落刺激因子受体抗体可特异性识别单核细胞、巨噬细胞及其祖细胞,单核细胞中始终存在巨噬细胞集落刺激因子受体,并且在分化为巨噬细胞后也持续高表达,表明其是金鱼巨噬细胞的特异性标记物[3]。香鱼巨噬细胞集落刺激因子受体基因也主要在头肾单核细胞/巨噬细胞、脾脏和头肾中表达,并且鳗弧菌(Vibrioanguillarum)感染后表达显著上调,表明其参与调控香鱼巨噬细胞的吞噬功能[4]。草鱼巨噬细胞集落刺激因子受体基因在单核/巨噬细胞中高表达,而在其他类型的白细胞中几乎检测不到,表明其可作为草鱼巨噬细胞的特异性标记[5]。草鱼巨噬细胞集落刺激因子受体基因的敲除不仅会导致单核/巨噬细胞处于抑炎状态,也会降低单核/巨噬细胞的吞噬活性。此外,研究表明,巨噬细胞集落刺激因子受体基因敲除会干扰斑马鱼胚胎至成鱼巨噬细胞的发育,从而使斑马鱼幼鱼表现出系统性巨噬细胞缺失[33]。也有研究表明,鱼类巨噬细胞集落刺激因子受体在单核细胞和巨噬细胞谱系中特异性高表达,并且对巨噬细胞的吞噬功能具有显著的调控作用,因此可以作为鱼类巨噬细胞的特异性标记物。

2 巨噬细胞的极化及相应标记物

单核(巨噬)细胞和中性粒细胞是鱼类中两类重要的吞噬细胞。鱼类单核细胞与哺乳动物中类似,从血管迁移到各种组织中分化发育为巨噬细胞,鱼类巨噬细胞不仅在非特异性免疫中具有吞噬和杀伤功能,在特异性免疫中作为抗原呈递细胞也发挥着重要作用。硬骨鱼类的细胞因子如白细胞介素-4、白细胞介素-13和γ-干扰素与巨噬细胞激活及分化有关,白细胞介素-1、γ-干扰素等活化巨噬细胞后,不仅可以通过分泌杀伤性物质杀死靶细胞或病原体,还可以通过分泌白细胞介素-1、γ-干扰素、肿瘤坏死因子-α等细胞因子来增强自身的免疫功能。通过类比T辅助细胞1和T辅助细胞2极化的概念,根据巨噬细胞对不同环境刺激的反应,可将其分为表型和功能不同的M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞[34]。

γ-干扰素诱导的M1型巨噬细胞可分泌大量炎症因子,能够抗血管形成、抗胶原蛋白合成及清除病原体,并与动脉硬化、胰岛素抵抗等代谢性疾病相关,被称为经典活化巨噬细胞[35-38]。M2型巨噬细胞主要参与炎症消除[37],抑制T细胞的增殖和活化,有助于组织再生[39]。M2型巨噬细胞又可分为M2a、M2b、M2c 3种亚型[40]。M2a型巨噬细胞主要由白细胞介素-4/13诱导,也称为愈合性巨噬细胞,可以产生多种抗炎因子,从而抑制炎症反应并促进血管生成[41]。M2b巨噬细胞被Toll样受体配体或白细胞介素-1受体激动剂等免疫复合物及凋亡细胞联合诱导后形成,具有抑制急性炎症反应、促进Th2免疫及体液免疫发生的作用。M2c巨噬细胞由白细胞介素-10、转化生长因子和糖皮质激素诱导后形成,能够抑制炎性反应、促进组织重塑[41-42]。

2.1 M1型巨噬细胞标记物

脂多糖、γ-干扰素和巨噬细胞集落刺激因子等刺激后极化的巨噬细胞称为炎症性巨噬细胞或M1型巨噬细胞。脂多糖通过哺乳动物Toll样受体4激活核因子κB(NFκB)、激活蛋白-1(AP-1)等信号因子,从而诱导下游γ-干扰素和肿瘤坏死因子-α表达,并产生M1型巨噬细胞的表型特征[43]。鱼类中的研究表明,体外脂多糖刺激后会引起巨噬细胞呼吸爆发、产生一氧化氮自由基并诱导促炎型细胞因子分泌[44]。此外,鱼类γ-干扰素单独或与脂多糖联合刺激都会增强巨噬细胞的吞噬功能,引起呼吸爆发,并诱导白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-12和肿瘤坏死因子-α等促炎性细胞因子及多种趋化因子表达[45]。目前,已报道的鱼类M1型巨噬细胞标记物包括诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、C-X-C型趋化因子11aa和C-X-C型趋化因子受体3.1等趋化因子及受体。

2.1.1 诱导型一氧化氮合酶

一氧化氮合酶(NOS)是一种同工酶,分布于巨噬细胞、神经吞噬细胞、内皮细胞及神经细胞中。哺乳动物一氧化氮合酶有3种亚型:一是正常状态下表达的神经型一氧化氮合酶(nNOS);二是内皮型一氧化氮合酶(eNOS);三是损伤后诱导表达的诱导型一氧化氮合酶,该亚型是由2个钙调蛋白和2个一氧化氮合酶连接构成的四聚体[46]。

系统发育表明,诱导型一氧化氮合酶基因在鲤与高等脊椎动物中高度同源,推测其与哺乳动物诱导型一氧化氮合酶相似,可以作为鱼类M1型巨噬细胞的标记物[6]。鲤头肾巨噬细胞被脂多糖刺激时会极化产生M1型巨噬细胞表型,且转录组测序分析发现,诱导型一氧化氮合酶基因表达显著上调。在大黄鱼肿瘤坏死因子-α诱导的促炎性巨噬细胞极化中,诱导型一氧化氮合酶等炎性细胞因子基因表达显著上调,并引起一氧化氮产生及呼吸爆发[7]。重唇鱼在肝脏表达抗菌肽2 (LEAP-2)单独或与脂多糖联合处理巨噬细胞时也可诱导M1型极化,其炎性反应包括引起巨噬细胞呼吸爆发,并促进诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α等炎性细胞因子基因表达显著上调[8]。

诱导型一氧化氮合酶在鱼类组织中广泛分布且能在病原侵染时快速应答,因而在鱼类中发挥着重要的免疫作用。鲑肾杆菌(Renibacteriumsalmoninarum)感染虹鳟后,诱导型一氧化氮合酶基因仅在鳃和头肾巨噬细胞中表达上调[9]。此外,虹鳟感染病毒性出血败血症后,脾、头肾和肝脏巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶基因被显著诱导表达[47],表明巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶在虹鳟抗病毒防御过程中也发挥了重要作用。鲤经过嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)刺激后,诱导型一氧化氮合酶基因在多组织中广泛被诱导表达,其中头肾巨噬细胞中的表达量上调最显著[46]。因此,诱导型一氧化氮合酶已被证明是参与鱼类多种免疫过程的重要效应酶,尤其在寄生虫[48-49]、细菌[50]和病毒[51]等病原体侵染后,巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶基因表达量均显著上调,表明其参与鱼类抵抗病原感染的炎症反应,是鱼类M1型巨噬细胞的重要标记物。

2.1.2 肿瘤坏死因子-α

肿瘤坏死因子-α属于TNF超家族成员,能增强杀伤细胞活性,抑制和杀伤肿瘤细胞,促进淋巴细胞增殖和分化[52],是机体抵抗细菌、寄生虫及病毒感染的重要炎性细胞因子[53]。肿瘤坏死因子-α主要由活化的巨噬细胞产生,M1型和M2b型巨噬细胞是分泌肿瘤坏死因子-α的主要细胞类型[37,54],在其他细胞如中性粒细胞、淋巴细胞、NK细胞和肥大细胞中也可以被诱导分泌[55]。

大黄鱼单核/巨噬细胞在肿瘤坏死因子-α1/α2蛋白处理后可大量诱导活性氧和一氧化氮产生,并引起炎性细胞因子诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子-α1、白细胞介素-1β、白细胞介素-6和白细胞介素-8基因表达上调,并增强巨噬细胞吞噬功能,表明肿瘤坏死因子-α可以诱导大黄鱼M1型巨噬细胞形成,且是重要的M1型极化标记物[7]。此外,建立的2种大黄鱼巨噬细胞系在脂多糖刺激后,肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β等炎性细胞因子基因表达量被诱导上调[10]。类似的是,香鱼巨噬细胞在脂多糖处理后也可诱导M1型极化标记物肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β基因表达上调,而该调控作用受到具有胶原结构的巨噬细胞受体抑制[11]。笔者所在实验室研究表明,团头鲂内凝集素蛋白孵育巨噬细胞后可以诱导M1型极化,并显著促进肿瘤坏死因子-α和诱导型一氧化氮合酶等炎性细胞因子表达上调,表明肿瘤坏死因子-α和诱导型一氧化氮合酶等可以作为团头鲂M1型巨噬细胞的极化标记物[56-57]。在斑马鱼极化巨噬细胞亚群的建立和鉴定研究中,M1型巨噬细胞主要以肿瘤坏死因子-α作为标记物进行鉴定[12]。上述研究表明,炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α作为鱼类巨噬细胞M1型极化标记物已得到广泛应用。

2.1.3 白细胞介素家族

白细胞介素是多种细胞分泌并可作用于多种靶细胞的一类细胞因子家族。因最初由白细胞分泌并作用于白细胞,并具有重要的调节作用,因此得名并沿用至今[58]。白细胞介素是在生物学功能和分子结构上已基本明确,且具有重要生物学调节作用的一类细胞因子。白细胞介素在信号传递,激活与调节免疫细胞,介导T细胞和B细胞活化、增殖与分化及炎症反应中发挥着重要作用。目前,已发现的白细胞介素成员至少有38个,分别被命名为白细胞介素-1～白细胞介素-38,功能复杂多样。有关白细胞介素的研究很多,本节主要综述与M1型巨噬细胞极化相关的标记物白细胞介素-1β和白细胞介素-6。

(1)白细胞介素-1β

白细胞介素-1β是鱼类炎症反应中最先分泌的细胞因子之一,也是M1型巨噬细胞的极化标记物,目前在鲤形目、鲑形目、鲈形目等多种类型鱼类中均已克隆、鉴定。虽然鱼类白细胞介素-1β与哺乳动物类似,但仍存在一定的差异。哺乳动物白细胞介素-1β具有7个外显子和6个内含子,而鲑形目鱼类白细胞介素-1β只含有6个外显子,鲈形目鱼类白细胞介素-1β只含有5个外显子,并且鱼类白细胞介素-1β的剪切机制还不完全清楚。

鱼类第一个白细胞介素-1β是通过同源克隆的方法在虹鳟中获得的,与哺乳动物白细胞介素-1β的氨基酸相似性为49%～56%,与鲤白细胞介素-1β的相似性为57%[59],此后鱼类白细胞介素-1β得到了广泛研究。脂多糖可诱导虹鳟白细胞介素-1β基因的表达,且其表达水平受脂多糖浓度、环境温度和皮质醇水平等因素影响。脂多糖质量浓度为1.5 μg/mL时诱导的白细胞介素-1β表达量约是质量浓度为0.1 μg/mL时的18倍,且脂多糖在22 ℃和14 ℃处理虹鳟头肾白细胞时白细胞介素-1β的转录水平分别是4 ℃处理时的8倍和2倍,而皮质醇却会抑制脂多糖对白细胞介素-1β的诱导表达作用[14]。此外,虹鳟白细胞介素-1β可诱导巨噬细胞环氧化酶2(COX-2)和Ⅱ型主要组织相容性复合体(MHC Ⅱ)的表达,并增强头肾白细胞的吞噬活性。大黄鱼重组白细胞介素-1β可增强其对溶藻弧菌(V.alginolyticus)的抵抗力,且在体外可诱导单核/巨噬细胞趋化,并增强巨噬细胞的吞噬和杀菌活性[15]。香鱼经鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)感染后,单核/巨噬细胞中的白细胞介素-1β蛋白表达显著上调,中和白细胞介素-1β不会改变香鱼头肾来源的单核/巨噬细胞的吞噬作用,但降低了其杀菌能力。因此,香鱼白细胞介素-1β可能在免疫应答中发挥重要作用,特别是参与单核/巨噬细胞对细菌的杀伤作用[16]。综上所述,鱼类白细胞介素-1β在炎症或病原感染时表达上调,并通过增强巨噬细胞的吞噬或杀伤功能发挥其免疫保护作用,且白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α作为鱼类巨噬细胞M1型极化的典型标记物已被广泛应用。

(2)白细胞介素-6

哺乳动物白细胞介素-6家族由白细胞介素-6、白细胞介素-11、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、抑瘤素M、心肌营养素-1、心肌营养蛋白样细胞因子等组成[58]。在鱼类中,白细胞介素-6是一种多功能的细胞因子,也是最重要的促炎细胞因子之一[60-61],具有广泛的生物学效应,在先天性免疫和获得性免疫方面都有着重要的功能[62]。在诱导巨噬细胞极化的经典方法中,脂多糖是诱导M1和M2b型巨噬细胞的常用刺激物,且白细胞介素-6在脂多糖诱导的M1和M2b巨噬细胞中高表达,但在M2a和M2c中表达较低。结合白细胞介素-10、ccl1等其他标记物,可通过白细胞介素-6从其他巨噬细胞亚群中鉴定M2b[35]。

2005年,利用人类和河豚基因组某些区域之间的同线性,在红鳍东方鲀(Takifugurubripes)中鉴定了鱼类中的第一个白细胞介素-6序列[63],鱼类白细胞介素-6的发现将允许对局部炎症反应进行更深入的研究。脂多糖、poly (I:C)和白细胞介素-1β等促炎因子可诱导虹鳟巨噬细胞系RTS-11和原代头肾巨噬细胞表达白细胞介素-6,虹鳟重组白细胞介素-6刺激增加了RTS-11细胞的数量,表明白细胞介素-6可以促进虹鳟巨噬细胞系RTS-11的增殖[17]。此外,虹鳟重组白细胞介素-6还可以诱导巨噬细胞铁调素的表达,从而通过抑制铁的吸收来增强巨噬细胞的抑菌功能。因此,鱼类白细胞介素-6在巨噬细胞炎症反应中被诱导表达后,可通过诱导铁调素表达来限制铁的获取,从而将铁缺乏作为限制病原侵染的一种手段[17]。鳗弧菌感染后香鱼白细胞介素-6基因在主要免疫组织和单核/巨噬细胞中的表达量均显著上调,重组白细胞介素-6孵育香鱼巨噬细胞可增强促炎细胞因子表达及其吞噬与杀菌能力,且白细胞介素-6受体β(IL-6Rβ)对该效应起主要调控作用[18]。研究表明,鲤巨噬细胞可以极化为M1和M2表型,并具有保守的功能和相应的转录谱,M1极化的巨噬细胞一氧化氮的产生增加,转录组测序分析表明白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-12、血清淀粉样蛋白A(SAA)等促炎细胞因子的转录水平增加[19]。由此可知,白细胞介素-6作为鱼类重要的M1型极化标记物能快速响应鱼类炎症反应和病原感染,并对巨噬细胞增殖、吞噬和杀菌功能起到促进作用。

2.1.4 趋化因子和趋化因子受体

趋化因子,由70～100个氨基酸组成,蛋白大小仅8～10 ku,是一类由细胞分泌的信号蛋白或细胞因子。趋化因子可以聚集并激活白细胞作用于感染部位参与免疫反应,在炎症反应和非特异性免疫中具有重要作用。趋化因子有多种分类方式,根据生理功能的不同,可将其分为诱导型趋化因子和组成型趋化因子[64],前者主要诱导嗜中性粒细胞、单核细胞、活化的T细胞等到炎症部位,后者主要是对机体起免疫监控和维持机体动态平衡的作用[64-65];根据趋化因子多肽链一级结构中前2个半胱氨酸的排列位置可分为4类,分别是:近氨基端的两个半胱氨酸之间还有一个其他氨基酸的为CXC亚族或α亚族,近氨基端的2个半胱氨酸紧密相连的是CC亚族或β亚族,近氨基端只有1个半胱氨酸的为C亚族或γ亚族,近氨基端的2个半胱氨酸之间有3个其他氨基酸的为CX3C亚族或δ亚族。此外,鱼类还拥有1类特有的CX亚族,而近些年来对鱼类的趋化因子的研究大都集中在CXC型和CC型2类[66]。CXC型和CC型趋化因子均可作用于嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核巨噬细胞[65,67]。趋化因子受体根据结合配体的不同可以分为4类:CCR,即CC亚族趋化因子的受体;CXCR,即CXC亚族趋化因子的受体;XCR,即C亚族趋化因子的受体;CX3CR,即CX3C趋化因子的受体。

趋化因子受体CXCR3被认为是香鱼、草鱼和黑青斑河鲀的M1(CXCR3.1)和M2(CXCR3.2)型巨噬细胞的标记物[20]。CXCR3.1和CXCR3.2基因对草鱼和黑青斑河鲀的巨噬细胞极化有调节作用,并首次证明了硬骨鱼巨噬细胞极化受趋化因子受体的调节。香鱼CXCL9-11l2和CXCL9-11l3通过与CXCR3.1相互作用诱导CXCR3.1+巨噬细胞趋化和M1表型,CXCL9-11l1和CXCL9-11l2通过与CXCR3.2相互作用诱导CXCR3.2+巨噬细胞趋化和M2表型。上述结果表明,在硬骨鱼中CXCR3.1和CXCR3.2通过与其特异性配体相互作用来介导巨噬细胞极化[20]。斑马鱼CXCL11aa是人类CXCL11的同源物,细菌感染时可作为M1型巨噬细胞极化的标记物[13]。综上所述,鱼类趋化因子及其受体种类繁多,在诱导鱼类巨噬细胞M1型和M2型极化或作为极化标记物方面都有较多的研究,表明鱼类趋化因子及其受体在巨噬细胞功能分化中扮演着重要角色。

2.2 M2型巨噬细胞标记物

2.2.1 精氨酸酶-2

精氨酸酶是一种能够水解L-精氨酸脒基并生成鸟氨酸与尿素的反应酶,一般存在于可产生尿素的动物如哺乳类、两栖类、板鳃鱼类、海龟类的肝脏、肾脏和精巢中,在植物与微生物中也有分布。精氨酸酶目前发现两种亚型:精氨酸酶-1和精氨酸酶-2,两者之间氨基酸序列约有60%的同源性[68],主要区别在于组织分布、亚细胞定位及免疫反应不同。精氨酸酶-1在肝脏中的表达量较高,催化L-精氨酸酶代谢为L-鸟氨酸和尿素,是尿素循环的最后步骤,对体内的氨解毒起着重要作用[69]。精氨酸酶-2是一种线粒体酶,主要存在于线粒体中[70],几乎在所有器官都有表达。鱼类精氨酸酶是一种M2型巨噬细胞的典型标记物。

与其他脊椎动物一样,硬骨鱼表达精氨酸酶-1和精氨酸酶-2两种精氨酸酶,但这两种异构体都存在线粒体靶向序列,表明这两种酶都是线粒体形式的。由此可见,精氨酸酶在鱼类中起线粒体酶的作用。鲤头肾巨噬细胞在环磷酸腺苷(cAMP)刺激下极化形成M2表型,其特征是精氨酸酶-2基因表达上调,但精氨酸酶-1基因表达不变,而在脂多糖诱导形成的M1型巨噬细胞中精氨酸酶-2基因表达无显著变化,表明精氨酸酶-2是鲤M2型巨噬细胞的重要标记物[6,21-22]。而且,鲤巨噬细胞极化为M2表型后抗炎介质增加,精氨酸酶活性增加,转录组测序分析表明,精氨酸酶-2等M2型极化标记物表达上调[19]。金头鲷前列腺素E2可通过cAMP/CREB信号途径诱导巨噬细胞M2型极化,并诱导精氨酸酶-2、甘露糖受体和白细胞介素-10等标记物基因显著上调表达[23]。虹鳟和大西洋鲑的精氨酸酶-1和精氨酸酶-2基因在不同的刺激下也具有差异的表达模式,病原相关分子模式(PAMPs)和促炎性细胞因子可以显著诱导精氨酸酶-1基因表达上调,而精氨酸酶-2基因表达主要受白细胞介素-4/13调控,表明虹鳟和大西洋鲑精氨酸酶-2是白细胞介素-4/13诱导的M2型极化的重要标记物[24]。类似的是,在金鱼和草鱼中的研究也表明,白细胞介素-4/13可显著上调精氨酸酶-2基因表达水平及精氨酸酶-2活性,从而促进草鱼巨噬细胞的M2型极化并抑制M1型极化的形成[25,28]。上述研究表明,精氨酸酶-2是鱼类巨噬细胞M2型极化的重要标记物,并已被广泛用于M2型极化鉴定。

2.2.2 清道夫受体CD163

清道夫受体(SR),是固有免疫中的一类重要模式识别受体,分为多种类型,主要包括SRA和SRB。其中,SRA含有6个半胱氨酸,SRB含有6～8个半胱氨酸。CD163属于SRB家族,是位于细胞表面的糖蛋白受体,分子质量为130 ku,在高等脊椎动物中作为参与组织损伤修复的M2型巨噬细胞标记物。CD163的存在方式有两种:一是在单核巨噬细胞上以跨膜大分子的形式存在,二是以可溶性CD163(sCD163)形式存在于组织液中[71]。CD163与sCD163均在抑制炎症反应方面起着重要的作用,因此也被认为是M2型单核巨噬细胞的特异性标记物[72-73]。目前,关于鱼类CD163的研究相对较少。通过定期监测虹鳟伤口中CD163基因的表达发现,受伤后1～3 d,CD163基因的表达量上调了10倍,受伤100 d后CD163基因表达显著性上调了17倍。而且,鱼类CD163的表达模式与M2c巨噬细胞在伤口中出现的预期时间一致,表明其是M2c巨噬细胞的重要标记物[26]。高等脊椎动物CD163对巨噬细胞的调控作用研究及其作为M2型极化标记物的应用较多,已有关于鱼类CD163的研究也表明其参与组织修复,但其作为鱼类M2型极化标记物的研究与应用还有待深入。

2.2.3 甘露糖受体

甘露糖受体(MR)又称CD206。甘露糖受体作为一种模式识别受体主要表达于巨噬细胞及树突细胞等免疫细胞表面[74],在识别病原、维持稳态、抗原递呈、诱导细胞因子等过程有着重要作用,同时也可用作巨噬细胞分型,其对巨噬细胞选择性较强[75],是M2型巨噬细胞的特异性标记物[76]。甘露糖受体属于多凝集素受体,可识别细胞表面或病原体细胞壁上的多种糖分子,通过参与受体介导的内吞和吞噬作用,将非特异性和特异性免疫联系起来,组成机体的免疫防御系统。鲤MRC-1B基因在未刺激的巨噬细胞中有较高的基底表达量,在脂多糖刺激后表达下调5倍,而在cAMP刺激后上调3倍,推测MRC-1B是鱼类重要的M2型巨噬细胞标记物[6]。类似的是,金头鲷前列腺素E2可通过cAMP/CREB信号途径诱导的巨噬细胞M2型极化中甘露糖受体作为标记物表达显著上调[23]。团头鲂甘露糖受体具有典型的C型凝集素样结构域,定位于细胞表面和胞内,这与哺乳动物巨噬细胞中甘露糖受体一致。此外,甘露聚糖和甘露糖受体特异性抗体抑制试验均表明,团头鲂甘露糖受体蛋白通过Ca2+依赖性方式介导了巨噬细胞的吞噬作用[77]。近些年,鱼类甘露糖受体对巨噬细胞的调控作用研究逐渐增多,并广泛应用于M2型巨噬细胞鉴定。

3 展 望

巨噬细胞作为重要的免疫细胞,在机体抗病及免疫过程中发挥着至关重要的作用。M1型巨噬细胞具有促炎作用,而M2型巨噬细胞的功能与M1型巨噬细胞相反,包括抑制炎症、促进修复及组织再生等。两类巨噬细胞在功能和表型方面具有显著差异,并分别具有特定的标记物,因此巨噬细胞标记物在不同极化类型巨噬细胞的鉴定、分选和功能研究中具有重要意义。目前,鱼类巨噬细胞标记物相关的研究较少,已鉴定的鱼类巨噬细胞标记物种类有限,且部分标记物仅在一种或少数鱼类中有报道,很多鱼类巨噬细胞标记物的研究依然需要参考高等脊椎动物的研究成果。基于鉴定的鱼类巨噬细胞标记物,可进行不同极化类型巨噬细胞的分选,并可促进鱼类巨噬细胞极化标记物与表型特征及功能分化之间的关联研究。因此,系统、全面地筛选巨噬细胞不同极化类型的标记物是鱼类巨噬细胞功能研究及分选的基础,也是鱼类巨噬细胞研究的重要方向。

此外,已建立的鱼类巨噬细胞系(株)较少,仅在虹鳟、大黄鱼、罗非鱼等少数鱼类中有报道。鱼类原代巨噬细胞具有分离步骤繁琐,贴壁率、体外培养时间不稳定等缺点,而细胞系相对于原代细胞具有重复性高、可标准化及实验操作方便等优势,可为鱼类巨噬细胞的功能研究提供较好的材料。而且,基于鱼类巨噬细胞系可以建立稳定的不同极化类型巨噬细胞模型,从而为系统研究异质性巨噬细胞的功能差异奠定基础。综上所述,对于鱼类巨噬细胞极化标记物的系统性鉴定及巨噬细胞极化模型的建立具有重要意义,有助于解析鱼类巨噬细胞在病原感染及炎症反应中的免疫调控机制,并为鱼类病害防治奠定理论基础。