全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎的急性毒性与致畸效应

刘笑楠，吴 昊，郑丽利，许 佳，高雪忠，高斐斐，江 敏,2

( 1.上海海洋大学 海洋生态与环境学院，上海 201306； 2.上海海洋大学，上海市水产养殖工程技术研究中心，上海 201306； 3.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306； 4.上海市奉贤区水产技术推广站，上海 201419 )

全氟辛烷磺酸作为一种全氟烷基化合物，具有较高的生物、化学和热稳定性[1]，被广泛应用于纺织、航空、造纸等行业。其具有难降解性、生物累积性、半挥发性和高毒性等特性，在2009年被增列为新的持久性有机污染物[2]。研究显示，目前世界各地水域中均存在不同程度的全氟辛烷磺酸污染[3-4]，如：德国莱茵河流域中全氟辛烷磺酸质量浓度可达28 ng/L[5]；美国田纳西州河水域中其质量浓度范围为16.8～54.1 ng/L[6]；日本东京湾水域和印度恒河水域中均检测到较高含量的全氟辛烷磺酸[7-8]。我国太湖附近水域中全氟辛烷磺酸质量浓度为9.8～121.0 ng/L[9]，海河流域检测到的最高质量浓度可达127 ng/L[10]。全氟辛烷磺酸具有很强的生物毒性，易在生物体内蓄积[11]。Sinclair等[12]研究表明，美国纽约州加拉河地区野生鲫(Carassiusauratus)肝胰脏中全氟辛烷磺酸的质量浓度达315 ng/g，而其在食肉性鸟类体内的含量比非食肉性鸟类高2.5倍。研究者在白鱼(Anabarilius)鱼卵中亦检测到了全氟辛烷磺酸，证明其能够在卵生鱼类的胚胎中进行转移，危害胚胎健康发育[13]。鱼类是人类社会重要的经济动物，也是生物链的重要环节[14]。近年来，随着全氟辛烷磺酸在水环境中的广泛检出，其对鱼类的多种毒性效应也愈发受到人们关注。胚胎作为鱼类发育的重要阶段，易受到环境中有害物质的影响而造成发育异常，因此开展全氟辛烷磺酸的鱼类胚胎毒性试验对研究其生态毒理效应具有重要意义。

斑马鱼(Daniorerio)作为常用的模式生物之一，其胚胎具有发育周期短、透明易观察和用量少等特点，常被用于鱼类毒理学研究。斑马鱼胚胎发育分为卵裂期(0.6～2.2 h)、囊胚期(2.7～6.0 h)、原肠胚期(6.6～10.6 h)、分裂期(12.1～23.8 h)、成形期(23.8～52.1 h)、孵化期(54.0～80.0 h)[15]。已有研究表明，全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎具有致死和致畸效应，但对其致死及致畸的质量浓度以及不同时期胚胎产生的畸形现象尚缺少更细致的数据。笔者在实验室条件下，分析全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎的急性毒性和畸形效应，探究其发育毒性，为全氟辛烷磺酸的环境安全评价及生态风险评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

全氟辛烷磺酸(C8HF17O3S)，纯度98.7%，购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。

实验室饲养的斑马鱼购自上海某养殖基地，体长(2.0±0.2) cm。正式试验前，将雌、雄斑马鱼分开，分别置于30 cm×30 cm×30 cm的玻璃鱼缸中驯养，养殖用水为曝气48 h的自来水，用加热棒控制水温在(26±2) ℃，每日8：00、12：00、17：00定时投喂开口饲料。驯养1个月后，选取健康雌、雄鱼交配产卵，在显微镜下筛选正常受精的健康胚胎用于急性毒性试验。

1.2 试验方法

试验所用斑马鱼胚胎为自行培育所得，收集鱼卵前12 h分别在驯养雌、雄斑马鱼的鱼缸中，选取鱼龄相当、性特征发育明显的健康斑马鱼，按雌、雄比例1∶2放入斑马鱼产卵繁殖盒中，并用格栅将雌、雄鱼隔开，放入恒温培养箱过夜。次日天亮后更换养殖水，再将产卵盒内的格栅抽出，让雌、雄鱼正常交配产卵，斑马鱼交配产卵2 h后，将雌、雄鱼分别放回原驯养缸中，使用消毒灭菌后的一次性吸管收集产卵盒底部的斑马鱼胚胎并在光学显微镜下进行筛选，取正常受精、发育状况良好的斑马鱼胚胎用于毒性胁迫试验。在胚胎卵裂期结束后进行染毒，观察全氟辛烷磺酸胁迫下，斑马鱼胚胎在不同时期的发育情况。

根据GB/T 13267—1991《水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》，采用静水式试验，在预试验基础上设计1个对照组和6个试验组(1.00、1.58、2.51、3.98、6.31、10.00 μg/mL)。取消毒杀菌后的96孔细胞培养板，选取7行，自上而下依次为对照组和6个试验组，每行选取10个孔，每孔1枚健康胚胎，试验设3组平行。染毒6、12 h后在荧光体式显微镜下观察胚胎的发育情况，之后每隔12 h观察1次，直至96 h。

试验以胚胎细胞的损毁、卵凝结、胚胎浑浊和无心跳等现象为死亡标志，记录不同时间胚胎死亡个数、孵化个数和平均心率值；使用荧光体式显微镜观察胚胎发育过程中的畸形现象。

按照改良寇氏法[16]，计算24、48、72、96 h时全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎的半致死质量浓度：

m=X-i(∑p-0.5)

(1)

(2)

式中，m为半致死质量浓度对数值，X为最大剂量的对数值，i为相邻两剂量组对数剂量差值，∑p为各剂量组死亡率之和，q为存活率，Sm为半致死质量浓度对数值的标准误差，n为每组胚胎数量。

使用Excel 2010处理试验数据，SPSS 25.0对数据进行单因素方差分析，通过最小极差法多重比较对数据进行显著性分析，使用Prism 8.0进行绘图。

2 结 果

2.1 全氟辛烷磺酸暴露对斑马鱼胚胎死亡率的影响

全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎24、48、72、96 h的半致死质量浓度结果见表1，其中96 h半致死质量浓度为2.67 μg/mL，根据经验公式[17]得到全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎的安全质量浓度为0.27 μg/mL。随着全氟辛烷磺酸暴露时间的延长，胚胎死亡数逐渐增多；相同暴露时间时，不同质量浓度全氟辛烷磺酸导致胚胎死亡率也有显著差异；暴露72 h时，10 μg/mL的全氟辛烷磺酸试验组胚胎死亡率达100%(图1)。

图1 不同质量浓度全氟辛烷磺酸暴露对斑马鱼胚胎死亡率的影响

表1 全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎的半致死质量浓度

2.2 全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎孵化率的影响

全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎孵化具有明显的抑制作用(图2)。当胚胎发育至96 h，除低质量浓度组(1.00、1.58 μg/mL)外，中高质量浓度组(2.51、3.98 μg/mL)和高质量浓度组(6.31、10.00 μg/mL)胚胎孵化率均低于50%。其中高质量浓度组在60 h后，不再孵化仔鱼。全氟辛烷磺酸质量浓度为10 μg/mL时，胚胎孵化率仅10%，且均在孵化破膜后12 h内死亡。

图2 不同质量浓度全氟辛烷磺酸暴露对斑马鱼胚胎孵化率的影响

2.3 全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎心率的影响

暴露于全氟辛烷磺酸中的斑马鱼胚胎心率会明显加快(图3)。胚胎发育至84 h，心脏功能趋于成熟，胚胎心率达到峰值，此时各试验组胚胎的心率均高于对照组。中高质量浓度组(2.51、3.98 μg/mL)全氟辛烷磺酸对斑马鱼心率的提升作用最强，低质量浓度组(1.00、1.58 μg/mL)与高质量浓度组(6.31 μg/mL)对斑马鱼胚胎心率的提升作用则弱于中高质量浓度组。

图3 不同质量浓度全氟辛烷磺酸暴露对斑马鱼胚胎心率的影响

2.4 全氟辛烷磺酸诱导斑马鱼胚胎发育产生的畸形现象

在全氟辛烷磺酸影响下，不同发育阶段的胚胎呈现不同的畸形现象，且畸变程度与全氟辛烷磺酸质量浓度正相关(图4)。当胁迫试验进行至48 h后，中高质量浓度组(2.51、3.98 μg/mL)和高质量浓度组(6.31 μg/mL)胚胎畸形率显著升高(P<0.05)，且随着暴露时间的延长，畸变现象愈发明显。发生畸变的胚胎在破膜后也出现活力较差、游动和觅食能力下降等现象，最终在破膜后一段时间内死亡。

图4 不同质量浓度全氟辛烷磺酸暴露对斑马鱼胚胎畸形率的影响

囊胚期：3.98 μg/mL及以上各试验组斑马鱼胚胎胚层细胞分裂异常，出现卵黄细胞隆起不显著和卵凝结等现象(图5)。

图5 全氟辛烷磺酸胁迫6 h的斑马鱼胚胎发育情况

原肠胚期：3.98 μg/mL及以上各试验组斑马鱼胚胎前后体轴形成受阻，胚层发育缓慢，出现了卵黄外突和原肠外突等畸形现象(图6)。

图6 全氟辛烷磺酸胁迫12 h的斑马鱼胚胎发育情况

分裂期：全氟辛烷磺酸暴露使胚胎肌节发育缓慢，2.51 μg/mL组胚胎胚轴末端生长被抑制，出现了明显的尾部畸变和卵黄囊异常现象，3.98 μg/mL及以上各试验组胚胎发育缓慢甚至出现萎缩(图7)。

图7 全氟辛烷磺酸胁迫24 h的斑马鱼胚胎发育情况

成形期：胚胎在全氟辛烷磺酸胁迫下所产生的畸变程度加强，2.51 μg/mL及以上各试验组可观察到胚胎的心率不稳并且后静脉血流速度也相应减慢，出现心包腔肿大、脊椎弯曲和尾部萎缩等现象(图8、图9)。

图8 全氟辛烷磺酸胁迫36 h的斑马鱼胚胎发育情况

图9 全氟辛烷磺酸胁迫48 h的斑马鱼胚胎发育情况

孵化期：斑马鱼胚胎受全氟辛烷磺酸影响表现出更明显的尾部萎缩和曲折、色素沉积减少、脊椎弯曲、心包腔肿大等现象(图10、图11)。

图10 全氟辛烷磺酸胁迫60 h的斑马鱼胚胎发育情况

图11 全氟辛烷磺酸胁迫72 h的斑马鱼胚胎发育情况

3 讨 论

3.1 全氟辛烷磺酸暴露对斑马鱼胚胎死亡率的影响

Yang等[18]研究发现，全氟辛烷磺酸对鱼类的96 h半致死质量浓度为4.20～81.18 μg/mL，陈艺红等[19]将斑马鱼胚胎暴露于10～90 μg/mL的全氟辛烷磺酸中，胚胎死亡率随其质量浓度升高而逐渐升高。郭晋姝等[17]发现，全氟辛烷磺酸暴露下的斑马鱼成鱼在24、48、72、96 h的半致死质量浓度分别为26.09、9.08、3.91、2.58 μg/mL。本试验中，全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎的24、48、72、96 h的半致死质量浓度分别为7.81、6.58、3.44、2.67 μg/mL，安全质量浓度为0.27 μg/mL，根据急性毒性分级标准，全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎的毒性为高毒。比较可知，全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎的24、48 h半致死质量浓度明显低于成鱼，说明胚胎比成鱼对全氟辛烷磺酸更为敏感。

3.2 全氟辛烷磺酸暴露对斑马鱼胚胎孵化率的影响

Shi等[20]发现，将斑马鱼胚胎暴露在5 μg/mL的全氟辛烷磺酸溶液中，胚胎孵化率显著降低；本试验中，3.98、6.31 μg/mL组的胚胎孵化率分别为43.3%和26.7%，均显著低于对照组。胡芹[21]发现，将斑马鱼胚胎暴露于0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的全氟辛烷磺酸溶液中，其孵化率会随质量浓度加大而显著降低，与本试验结果一致。另有研究表明，全氟辛烷磺酸会造成斑马鱼胚胎细胞膜损伤，抑制胚胎的孵化[22]；本试验亦观察到相似现象，各试验组胚胎均出现孵化延缓现象，高质量浓度的6.31、10.00 μg/mL组部分胚胎未能孵化即死亡。

3.3 全氟辛烷磺酸暴露对斑马鱼胚胎心率的影响

赵雪松等[23]研究表明，将斑马鱼胚胎分别暴露于5、10 μg/mL的全氟辛烷磺酸溶液中，48 h时胚胎心率与对照组无明显差异，而84 h时显著高于对照组；另有研究表明，暴露在1.00、10.00 μg/mL全氟辛烷磺酸中的斑马鱼仔鱼心率在96 h时高于对照组，并且仔鱼心率在一定范围内会随全氟辛烷磺酸质量浓度的增加而加快[24]。本试验中，当斑马鱼胚胎心率达到峰值时，与对照组相比，中高质量浓度组(2.51、3.98 μg/mL)的胚胎心率增加最明显，低质量浓度组(1.00、1.58 μg/mL)和高质量浓度组(6.31 μg/mL)则弱于中高质量浓度组。这可能是由于高质量浓度全氟辛烷磺酸会抑制胚胎心脏的发育，造成心房水肿，加大心脏对血液的传导压力，使全氟辛烷磺酸对胚胎心率的诱导作用减弱[25]。

3.4 全氟辛烷磺酸诱导斑马鱼胚胎发育产生的畸形现象

全氟辛烷磺酸对幼体发育具有明显的致畸效应[26]。有研究表明：全氟辛烷磺酸可以干扰多种信号蛋白通路进而扰乱细胞间隙的连接通信，以此破坏细胞稳态，造成细胞分裂异常[27-28]；全氟辛烷磺酸暴露使细胞膜的流动性和通透性增加，使细胞易受到污染物质影响而产生凋亡[29]；并且高质量浓度全氟辛烷磺酸暴露会导致斑马鱼胚胎出现卵凝结，影响原肠胚的形成[22]。笔者发现，在囊胚期和原肠胚期，全氟辛烷磺酸暴露下斑马鱼胚胎细胞也出现卵裂不规则、原肠外突和卵凝结等畸形。Dasgupta等[30]研究发现，全氟辛烷磺酸可通过影响斑马鱼体内脂质转运和代谢平衡来影响幼体肝脏功能，造成幼体畸形，这也被认为是造成胚胎尾部畸变和卵黄囊异常的诱因之一。本试验中，在发育分裂期也观察到斑马鱼胚胎明显的尾部畸变和卵黄囊异常现象，包括尾部曲折、尾部发育萎缩和卵黄囊异常肿胀等，并且全氟辛烷磺酸质量浓度越高，畸形越明显。Harada等[31-32]研究发现，全氟辛烷磺酸会影响心肌细胞的膜电位和钙离子通道，加速Ca2+的内流，造成幼体心肌肿大，影响心脏发育相关基因的表达，损坏心脏功能。笔者亦观察到高质量浓度全氟辛烷磺酸暴露下的胚胎心肌和心包腔肿大、心率不稳等现象。

4 结 论

试验以斑马鱼为研究对象，开展全氟辛烷磺酸对其胚胎的急性毒性和畸形效应试验，确定全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎24、48、72、96 h的半致死质量浓度分别为7.81、6.58、3.44、2.67 μg/mL，安全质量浓度为0.27 μg/mL，对斑马鱼胚胎为高毒性。成形期(23.8～52.1 h)的斑马鱼胚胎比成鱼对全氟辛烷磺酸更加敏感；全氟辛烷磺酸暴露下的斑马鱼胚胎出现死亡率升高、心率增加和孵化延迟现象。全氟辛烷磺酸会诱导斑马鱼胚胎在不同发育时期发生畸变，1.00～1.58 μg/mL的全氟辛烷磺酸对胚胎的致畸作用相对较弱；全氟辛烷磺酸质量浓度为2.51～10.00 μg/mL时，胚胎出现显著畸变，正常发育受到影响。笔者通过分析全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎的急性毒性和致畸效应，表明全氟辛烷磺酸对斑马鱼胚胎具有显著的发育毒性，可为全氟辛烷磺酸的环境安全评价及生态风险评估提供参考。