基于高通量测序的长江口中华绒螯蟹雌蟹食性分析

徐静静，冯广朋，张 涛，耿 智，杨 刚，宋 超，李春波

( 1.中国水产科学研究院 东海水产研究所，上海长江口渔业资源增殖和生态修复工程技术研究中心，上海 200090； 2.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306 )

长江口海陆交汇，生境独特，营养物质极其丰富，为水生生物提供了充足的饵料基础。营养相互作用机制是生态学中的一个基本问题，倍受生物学研究者的关注，其研究结果能为动物生态习性解析、物种进化分析及生物资源保护提供参考依据[1]。传统水生动物食性分析方法主要依赖胃肠食物中未被完全消化的组织器官的形态学特征进行鉴定，然而鉴定过程中常会遇到因食物仅剩微小颗粒而导致种类难以分辨确认的问题。

目前随着分子生物学技术的发展，高通量技术逐渐得到应用，并被扩展到水生生物食性分析领域。相比于传统的食性形态学分析方法，高通量技术具有检测灵敏(能捕获频次较低的DNA序列)、样本量少、精确度高等优点。通过将测序结果与相关数据库比对，可将食物的分类精确到种一级分类单元。目前国内外学者利用高通量测序技术在食性分析研究方面取得了较好进展，对食肉动物豹猫(Prionailurusbengalensis)[2]、褐家鼠(Rattusnorvegicus)[3]、奥地利滑蛇(Coronellaaustriaca)[4]等食性进行了研究。高通量技术还被用于海洋生物的食性分析，如Leray等[5]利用高通量测序技术分析了3种鱼的食物组成，检测到292个运算分类单元(OTU)，其中51%的单元可鉴定到种水平，另外26%的单元可鉴定到属水平。

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)主要分布于我国长江流域，属洄游性甲壳类动物，成蟹性腺发育至Ⅳ期后由淡水栖息地向长江河口咸淡水区进行生殖洄游。繁殖期作为中华绒螯蟹生活史最重要的生命阶段，是决定其种群资源量的关键阶段。饵料摄食是影响其繁殖的重要因素之一，是生态学研究的主要焦点之一。对于中华绒螯蟹食性已有较多研究，如：Rudnick等[6]对中华绒螯蟹生活史不同阶段食性进行了研究，指出中华绒螯蟹在溞状幼体和大眼幼体阶段主要摄食浮游植物与浮游动物，在幼蟹阶段主要摄食水生植物，二龄成蟹食性为偏肉食性的杂食性，在天然水域中主要摄食水生植物、附着藻类、小杂鱼、虾类、贝类、水生昆虫和蠕虫[7-9]；胃含物形态学食性分析表明，繁殖期中华绒螯蟹雌蟹抱卵前后的饵料组成复杂，包括水生植物、藻类、甲壳类、多毛类、鱼类、软体动物、棘皮动物、卵、颗粒碎屑等种类[10-11]。从长江口采集的中华绒螯蟹雌蟹样品，由于肠胃内食物消化程度较高，应用传统的形态学鉴定方法研究其食性仍存在一定的困难和不足。因此，笔者通过高通量测序技术对长江中华绒螯蟹雌蟹的食性进行对比研究，以期揭示生殖洄游期中华绒螯蟹雌蟹的食物种类组成，掌握雌蟹在抱卵前后的食性变化特征，为长江口中华绒螯蟹栖息地修复和资源增殖保护提供科学依据，并探讨高通量技术在水生生物食性分析中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

利用单船桁杆底拖网在长江口东滩水域(E 122°4′～122°11′、N 31°20′～31°25′)采集生殖洄游期中华绒螯蟹雌蟹，其中，抱卵前雌蟹采样时间为2017年11月，抱卵后雌蟹采样时间为2018年2—4月。随机选取规格相似、活力较强的抱卵前雌蟹20只和抱卵后雌蟹17只作为试验样本。试验样本用75%乙醇进行体表消毒后，在超净工作台上解剖取出肠道，-80 ℃保存待测。

1.2 试验方法

提取抱卵前后的雌蟹DNA，稀释后的基因组DNA使用带Barcode特异性引物18S V4区: 528F(GCGGTAATTCCAGCTCCAA)-706R(AATCCRAGAATTTCACCTCT)进行目的基因扩增。根据PCR浓度进行等质量混样，使用1×TAE的2%琼脂糖凝胶电泳纯化充分混匀后的PCR产物，割胶回收目标条带。使用Thermo Scientific公司GeneJET试剂盒进行产物纯化。使用Thermo Fisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒进行文库构建，文库经Qubit定量并检测合格后，使用Thermo Fisher的IonS5TMXL进行上机测序。

1.3 数据处理

根据MiSeq测序数据的低质量分数集中于末端的分布特点，对原始数据进行质量控制。根据Barcode将序列按样品拆分，并去除Barcode；利用Trimmomatic软件对双端序列分别去除：去除尾部质量值低于25 bp的碱基；同时设置50 bp滑动窗口，1 bp步移，窗口内碱基平均质量不低于25 bp；最后去除长度低于100 bp的序列；利用Flash软件将高质量双端序列进行连接，最小overlap区10 bp，最大错配率0.2，去除含模糊碱基N的序列。

按照序列相似性97%聚类后取丰度最高的1条序列作为1个运算分类单元。分析使用Uparse软件(Edgar，2013)得到相应的运算分类单元丰度表。注释分析通过GenBank库对分类信息进行注释。将GenBank库得到的非饵料信息(主要是一些真菌类生物)手动去除，利用SPSS 22.0软件对注释到的饵料进行统计分析。利用Mothur软件(Schloss，2009)绘制Shannon曲线用以检测样品数据量的合理化。

2 结果与分析

2.1 PCR产物条带

PCR产物目的条带大小为400～450 bp，总量满足2次或者2次以上建库需要，可进行后续建库(图1)。

图1 中华绒螯蟹雌蟹肠含物PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 高通量测序序列

长江口中华绒螯蟹雌蟹37个样本的高通量测序统计结果见表1，测序总序列为56 856～93 305个，用于分类的序列为53 288～90 598个。样本的稀释曲线见图2，在97%相似性为阈值的条件下，测序的数据量可以达到样品物种多样性评估的要求。

图2 不同样品组稀释曲线

表1 测序结果

37个样品通过聚类分析共得到423个运算分类单元，通过GenBank库BLAST比对，注释得到雌蟹的饵料组成。手动去除注释结果中非真核生物信息，通过GenBank库比对出来的饵料种类包括：硅藻门、绿藻门、甲藻门、金藻门、红藻门、高等植物、鱼类、甲壳类、浮游动物、软体动物、原生动物等(表2)。

表2 饵料种类分析结果(运算分类单元比对的饵料种类)

2.3 抱卵前后饵料组成的多样性

雌蟹抱卵前后鉴定的物种数量表明，抱卵前雌蟹的饵料组成物种数量大于抱卵后(表3)。抱卵前后的多样性指数如Shannon指数和Simpson指数无显著性差异(P>0.05)，丰富度指数如Chao1指数和ACE指数抱卵前显著大于抱卵后(P<0.05)。

表3 不同组别物种数和多样性指数

门水平上数量分析表明：雌蟹抱卵前食物种类占比较高的饵料为高等植物、节肢动物门、鱼类、硅藻门和甲藻门，占比分别为57.92%、16.18%、9.09%、7.23%和3.91%；抱卵后食物种类较高的饵料为高等植物、硅藻门、甲藻门和节肢动物门，占比分别为43.96%、20.91%、13.51%和9.34%(图3)。

图3 雌蟹抱卵前后门水平上主要饵料种类

属和种水平上数量分析表明，雌蟹抱卵前食物组成中占比较高的饵料为芦苇、中肋骨条藻、金鱼藻、安氏白虾、凤眼莲、桡足纲和，占比分别为29.31%、10.53%、8.9%、5.68%、5.90%和5.13%；抱卵后雌蟹食物组成中占比较高的饵料为芦苇、中肋骨条藻、甲藻门、金鱼藻和海链藻属，占比分别为39.56%、16.99%、9.51%、8.53%和6.56%(图4)。

图4 雌蟹抱卵前后属和种水平上的饵料种类

属和种水平上饵料种类桡足类、秀丽织纹螺、安氏白虾、斑尾刺虾虎鱼和的百分比抱卵前大于抱卵后；而芦苇、中肋骨条藻、互花米草、海链藻属和甲藻门的百分比抱卵后大于抱卵前(图5、图6)。

图5 雌蟹抱卵前后门水平上饵料类型的差异性

图6 雌蟹抱卵前后属水平上的差异性

藻类、高等植物、动物性饵料在雌蟹抱卵前占比分别为14.72%、57.92%和27.70%；在抱卵后食物组成中占比分别为42.40%、43.96%和13.85%。雌蟹抱卵前倾向喜好动物性饵料，抱卵后倾向喜好植物性饵料(图7)。

图7 雌蟹抱卵前后的饵料选择性

2.4 抱卵前后食物组成中的优势种类

芦苇和中肋骨条藻是生殖洄游期中华绒螯蟹的优势饵料，抱卵前占比分别为29.31%和10.53%；抱卵后占比分别为39.56%和16.99%(图8)。

图8 雌蟹抱卵前后的优势饵料

3 讨 论

3.1 长江口中华绒螯蟹的饵料组成

高通量测序方法分析表明，长江口生殖洄游期中华绒螯蟹雌蟹的饵料种类主要为硅藻、绿藻、甲藻、金藻、红藻、高等植物、鱼类、节肢动物、软体动物、浮游动物、原生动物等，这与中华绒螯蟹属于杂食性动物的结果基本一致。关于中华绒螯蟹的食性，已有的研究结果表明，植物性饵料主要为菹草(Potamogetoncrispus)、苦草(Vallisneriaspiralis)、金鱼藻、马来眼子菜(P.malaianus)、黄丝草(P.maackianus)、黑藻(Hydrillaverticillata)等[9,11]。基于高通量技术的食物组成研究结果与已有的传统形态学食性分析结果存在一定差异，主要是食物组成中的鱼类部分差异较大。藻类的鉴定结果与胃含物分析结果基本保持一致，硅藻为优势藻类，其中以中肋骨条藻、琼氏圆筛藻、舟形藻数量最多，这可能与长江口冬季优势藻类为中肋骨条藻和圆筛藻有关[12]。芦苇、海三棱藨草、互花米草、金鱼藻、凤眼莲等被高通量测序技术鉴定出的高等植物食物，与长江口岛屿湿地的自然植物资源组成一致[13]。秀丽织纹螺、安氏白虾、瓣鳃类、桡足纲、中华华哲水蚤等被高通量测序技术鉴定出的食物种类，在相关研究中亦有类似结果[10-11]。然而，高通量测序鉴定出了、斑尾刺虾虎鱼等鱼类，但中华绒螯蟹活动较慢，难以直接摄食这些游动较快的鱼类[6]，因此，这些鱼类的出现，可能是其水体中尸体被中华绒螯蟹摄食的结果。在饵料鉴定的结果中，抱卵前雌蟹中还检测到江氏伪钟虫(Pseudovorticellajiangi)寄生虫的存在，这与耿智等[14]研究发现的长江口中华绒螯蟹存在寄生虫的研究结果相符合。

3.2 雌蟹抱卵前后饵料的差异性

高等植物是雌蟹抱卵前后食物组成中占比最多的种类，饵料占比分别为57.92%和43.96%。其中，高等植物中芦苇占比最高，这不仅与芦苇是长江口最主要的植被类型，其本身具有很强的适应酸碱变化的能力有关[15]，还与中华绒螯蟹喜食有关[16]，与景丽[17]的研究结果——中华绒螯蟹对水生维管束植物芦苇的摄食率最高一致。本研究结果表明，中华绒螯蟹雌蟹动物性饵料占比在抱卵前大于抱卵后，原因是：抱卵前雌蟹长江口水温较高，活力更强，可以摄食更多的饵料种类，满足其性腺发育和交配产卵等繁殖能量支出需求[18]；相对来说，抱卵后雌蟹的摄食能力减弱[6]，导致其摄食饵料种类亦相应减少；另一方面，抱卵前长江水域浮游生物等饵料种类更丰富，密度更高，从而抱卵前雌蟹能摄食获取更多的动物性饵料，致使动物性饵料的占比更高。这与长江口水域潜在饵料组成与密度的季节变化规律一致[19]。

3.3 高通量测序与胃含物分析结果的差异性

胃含物分析食性研究的应用方向主要为5个，即研究生物的摄食组成、摄食行为/选择、摄食强度、生态转换效率和生态位[20]。高通量测序分析结果表明，雌蟹抱卵前主要饵料为高等植物、甲壳动物和鱼类，抱卵后主要饵料为高等植物和藻类；而胃含物分析结果是抱卵前后的雌蟹饵料组成以藻类和碎屑为主。两者之间具有一定差异性，主要是由两种鉴定技术方法的特点不同所致。一方面，胃含物中存在的不可分辨物和颗粒碎屑可能是植物和动物经消化和分解形成的，形态学方法难以鉴定，而在高通量测序中可以被鉴定出，所以高等植物和动物性饵料占比增大；另一方面，胃含物法分析对象主要为胃内含物，而高通量分析对象主要为肠容物，藻类易消化吸收，当食物残渣到达肠道时藻类已被大部分消化，造成高通量研究结果中藻类占比减少。因此，通过高通量测序方法研究分析水生动物的食物组成，在一定范围内是一种既高效又精确的研究方法[21]，这种方法可以发现传统基于显微镜下检查看不见的饵料生物；如果参考数据库是全面的，还可以鉴定出比胃含物分析法更精确的饵料分类水平[22]。

虽然高通量测序数据量大[23]，能够以更高的检出率鉴别饵料，但是与胃含物分析法相比，也存在一些不足之处：一是高通量测序技术无法辨别饵料生物的不同生命阶段。因为不论幼体阶段还是成体阶段，其DNA都是相同的。高通量也很难区分饵料是被直接摄入进入肠胃中，还是由于被其他饵料带入导致被检出[24]。由于中华绒螯蟹为杂食性动物，其摄食进入肠胃食物中的内容物(即雌蟹饵料组成中动物所摄食的食物种类)会对高通量测试结果造成一定干扰。因此，在应用高通量测试分析食性前，应将研究对象的肠胃内容物分离去除，或者根据参考资料，将食性组成结果中不可能客观存在的种类删除，尽可能降低二次摄食对结果的影响。二是高通量测序技术往往无法准确区分食物种类组成的比例。如在食物组成中，种类占比很小的食物可能其摄食量很高，导致比例数值失真。但对于本试验而言，主要是针对雌蟹抱卵前后的食物种类组成进行比较，通过高通量测序结果可以获得食物组成变化的特征信息，掌握纵向比较的变化规律。本试验结果中还出现了大量中华绒螯蟹自身DNA序列，原因可能是一部分序列来自其自相残食的结果[25]，另外可能是在DNA提取的过程中，自身基因对试验结果的影响，这与Deagle等[26]研究表明广食性动物的胃含物中存在大量宿主DNA相一致。本研究结果显示，高通量测序分析方法可揭示水生动物的食物种类组成信息[27-28]，但仍需与传统的胃含物分析方法相结合，才能更准确全面地解析其食性特征。今后随着科研技术不断发展完善，高通量测序技术可以为进一步为研究探讨鱼类等动物的食物组成、食性转变、生物防治、资源分配、物种自身特性[29]等提供技术支撑，并有望为深入研究捕食性和植食性动物的食物网提供理想的平台[30-31]。

4 结 论

通过高通量测序方法对长江口中华绒螯蟹雌蟹食性的研究表明，主要饵料种类为硅藻、绿藻、甲藻、金藻、红藻、高等植物、鱼类、甲壳类、软体动物、浮游动物、原生动物等。抱卵前主要饵料为高等植物(57.92%)、甲壳动物(16.18%)和鱼类(9.09%)；抱卵后的主要饵料为高等植物(43.96%)和藻类(42.40%)。高通量测序分析雌蟹食性的结果与传统胃含物分析的结果具有一定的差异性，主要是因为：胃含物法取样材料为胃内饵料，高通量取样材料为肠容物，藻类易消化吸收，导致高通量结果中藻类占比减少；另外高通量检测方法灵敏度高，导致正在消化过程中的高等植物和动物性饵料亦被检出，从而占比增大。高通量测序分析方法可在一定程度上揭示水生动物的食物种类组成信息，今后在鱼类食性研究中将具有更广阔的应用前景。