2种抗雌激素药物对雄性中华鳖脂代谢的影响

汪桂宇，王璐明，巫旗生，岑双双，马 晓，李学军

( 1.河南师范大学 水产学院，河南 新乡 453007； 2.福建省水产研究所，福建 厦门 361000 )

雌激素功能广泛，是非哺乳脊椎动物性别分化的关键，也参与动物机体脂代谢。雌激素促进肝脏中甘油三酯、胆甾醇酯、游离脂肪酸的合成，并组装成极低密度脂蛋白[1-2]。雌激素失调会影响脂肪细胞分化、脂解作用和脂质合成[3]。由芳香化酶基因(Cyp19a1基因)编码的芳香化酶，是雄烯二酮、睾酮转化为雌酮和雌二醇的关键酶[4-5]。Cyp19a1基因敲除的小鼠会产生性逆转，同时腹部和肝脏部位的脂肪含量明显增加[6]。此外，高脂饮食也会导致雄性小鼠脂肪组织芳香化酶的表达量增加，引起机体雌激素水平升高[7]。以上结果表明，芳香化酶在雌激素脂代谢中扮演着重要角色[8]。

雌激素受体拮抗剂是一种甾体类选择性雌激素受体调节剂、雌激素受体的特异性拮抗剂[9]。有研究报道，雌二醇通过激活脑内雌激素受体抑制女性的进食行为。去卵巢的雌性大鼠后脑灌注雌激素受体拮抗剂，可明显减弱雌二醇对食物摄取的抑制作用[10]。来曲唑作为人工合成的第3代非甾体类选择性芳香化酶抑制剂被广泛应用于性别分化相关研究[11]。芳香化酶抑制剂和激素受体拮抗剂处理试验结果一致，均可改变大鼠性别[12]。来曲唑通过结合芳香化酶中亚铁血红素的铁原子，抑制芳香化酶活性，进而抑制雄激素转化为雌激素，使雌激素水平下降。雌激素功能发挥需要与其受体结合，肝脏中的脂代谢基因受雌激素受体的调控[13]。因此，降低雌激素水平或干扰其作用途径均会影响到机体脂代谢水平。

中华鳖(Pelodiscussinensis)属爬行纲龟鳖目鳖科鳖属[14]，俗称水鱼、甲鱼、团鱼等，是我国重要的特种经济水生动物之一，具有较高的经济价值[15]。雄性中华鳖具有生长速度快、抗逆性强、裙边宽厚等优点[16]，因此性腺分化与发育是中华鳖相关研究的重要内容[17]。通过抑制雌激素合成培育出全雄个体，是鱼类单性育种的主要手段[18]。芳香化酶在暗纹东方鲀(Takifuguobscurus)雌性性腺分化功能维持上发挥重要作用[19]。利用芳香化酶抑制剂来曲唑，降低暗纹东方鲀稚鱼性腺型芳香化酶的基因表达，导致雌性稚鱼的性逆转[20]。中华鳖性别分化过程中，雌激素合成关键基因芳香化酶表达降低，也可以培育性逆转的雄性个体[16]。然而，雌激素分布于动物多个器官，具有多重功能。有研究表明，雌激素缺乏会导致雌性斑马鱼(Daniorerio)体内脂代谢失调[21-23]，但其他水产动物脂代谢的相关研究尚少。

脂肪在中华鳖生长发育和生殖发育过程中必不可少。据报道，性成熟的关键时期，2龄中华鳖，生殖性腺增长增大，雄鳖睾酮和雌二醇合成量达到峰值[8]。其中，雌二醇是雄性性腺发育过程中的重要雌激素。雌激素受体拮抗剂与芳香化酶抑制剂2种药物能分别阻断雌激素与受体结合及雌激素合成，通过影响雌激素的功能影响性腺发育，改变性腺对脂类物质的需求，从而影响中华鳖的脂肪代谢。

为探究中华鳖雌激素和脂代谢的关系，笔者在雄性中华鳖腹腔中注射芳香化酶抑制剂和雌激素受体拮抗剂，分析肝脏组织形态和Cyp19a1基因、脂代谢基因(Fas、Scd、Pparγ、Bmp4、Stat3基因)表达变化，讨论中华鳖体内雌激素缺乏后对脂代谢的影响，为后续采用性激素诱导、基因编辑等技术培育全雄个体提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 雌激素受体拮抗剂和芳香化酶抑制剂处理

试验用健康2龄雄性中华鳖(300～350 g)取自固始县晨源水产养殖专业合作社，饲养在河南师范大学水产基地。设置对照组、高剂量组和低剂量组3组，每组5只中华鳖。分别使用7、14 mg/(kg·d)的雌激素受体拮抗剂(索莱宝，中国)和5、10 mg/(kg·d)来曲唑试剂(索莱宝，中国)对中华鳖进行腹腔注射。处理组以二甲基亚砜作为溶剂[24]，对照组注射等体积的二甲基亚砜。每周对中华鳖进行腹腔注射1次，雌激素受体拮抗剂注射6周，芳香化酶抑制剂注射7周；采样前禁食12 h，于雌激素受体拮抗剂处理后1、4、42 d和芳香化酶抑制剂处理后1、2、3、49 d收集肝脏组织，对照组分别在处理后1、2、3、4、42、49 d收集样品。冰上进行取样，样品经液氮快速冷冻，-80 ℃储存。取雌激素受体拮抗剂处理后的肝脏组织，保存在多聚甲醛溶液中备用。

1.2 油红O染色

肝脏组织在多聚甲醛溶液中固定24 h，冰冻切片包埋剂包埋后，进行冷冻切片，切片厚15 μm。切片复温干燥，用体积分数10%的福尔马林固定15 min，蒸馏水冲洗，用体积分数60%的异丙醇内浸洗20～30 s晾干。再将切片组织放入新鲜过滤的油红O工作液中浸染8～10 min(加盖避光)，60%异丙醇清洗，去除染液。Mayer苏木精染色液复染1～2 min，纯水浸洗后，用体积分数1%的盐酸溶液分化，蒸馏水清洗。稀碳酸锂溶液促蓝，冲洗后镜检。甘油明胶或阿拉伯糖胶封固后，使用Leica DM 60008显微镜观察并拍照。

1.3 总RNA提取

Trizol法提取肝脏组织总RNA，1%体积分数琼脂糖凝胶电泳检测完整性，紫外分光光度法测定浓度，使用反转录试剂盒Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大连)获得第一链cDNA，以1 μg 总RNA为模板逆转录合成cDNA。

1.4 实时荧光定量分析

相关基因引物根据美国国家生物技术信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中华鳖基因组序列设计，使用Primer Premier 5.0软件设计定量引物(表1)。Gapdh基因作内参，进行实时荧光定量PCR，试验流程参照Bio-Rad SYBR实时荧光定量PCR测定试剂盒的操作说明。荧光定量PCR反应体系(10 μL)：2×SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，大连)5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL；反应程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个处理设置3个平行。

表1 用于实时荧光定量PCR分析的引物序列

1.5 数据分析

用2-ΔΔCt法计算荧光定量相对表达水平，结果用平均值±标准误表示。运用SPSS 20.0软件对表达数据进行正态性检验和方差齐性检验，检验通过后进行双因素方差分析，显著性差异水平设置为0.05。

2 结 果

2.1 不同剂量的雌激素受体拮抗剂处理后油红O染色结果

经雌激素受体拮抗剂处理的肝脏组织，冷冻切片油红O染色后，于光学显微镜下观察。肝脏组织内脂滴被亲脂的油红O着色而呈鲜红色，细胞核因苏木精着色而呈蓝色(图1)。由图1a、b可见，经染色后，细胞核呈蓝色，细胞质无色。雌激素受体拮抗剂处理后，脂滴呈深红色。低剂量雌激素受体拮抗剂处理组的脂滴在胞质内的积累量明显增加(图1c、d)。高剂量雌激素受体拮抗剂处理组的脂肪细胞体积显著增大(图1e、f)。

图1 不同剂量雌激素受体拮抗剂处理肝脏组织

2.2 芳香化酶抑制剂与雌激素受体拮抗剂处理对肝脏内雌激素代谢基因表达的影响

不同剂量的雌激素受体拮抗剂处理后1 d，随剂量增加Cyp19a1基因表达量降低，处理后4、42 d，随剂量增加Cyp19a1基因表达量显著升高(P<0.05，图2a)。芳香化酶抑制剂处理后1 d，低剂量组表达量降低，高剂量组表达量升高；处理后2 d，低剂量组显著升高，高剂量组降低(P<0.05)；处理后3 d，处理组的表达量显著升高(P<0.05)；处理后49 d，低剂量组表达量升高，高剂量组表达量降低(P<0.05，图2b)。

图2 芳香化酶抑制剂和雌激素受体拮抗剂注射雄鳖后Cyp19a1基因表达

2.3 芳香化酶抑制剂与雌激素受体拮抗剂处理对脂肪代谢相关基因表达的影响

雌激素受体拮抗剂处理后1、4 d，处理组Fas基因表达量降低，42 d后处理组表达量显著升高(P<0.05，图3a)。同样，在雌激素受体拮抗剂处理42 d后处理组Pparγ基因表达量显著升高(P<0.05，图3b)。雌激素受体拮抗剂处理后1 d，随剂量增加Scd基因表达量降低，4 d后，低剂量组Scd基因表达量升高，高剂量组表达量降低，42 d后处理组表达量均显著升高(P<0.05，图3c)。雌激素受体拮抗剂处理后42 d，随剂量增加，Stat3基因表达量显著升高，处理组Bmp4基因的表达量也显著升高(P<0.05，图3d、e)。

图3 雌激素受体拮抗剂处理后脂代谢基因表达

芳香化酶抑制剂处理后1、2、3 d，随剂量增加Fas基因表达量显著升高，49 d后低剂量组Fas基因表达量升高，高剂量组表达量无显著差异(P<0.05，图4a)。芳香化酶抑制剂处理后2、3 d，高剂量组Pparγ基因表达量显著升高(P<0.05，图4b)。经过芳香化酶抑制剂处理后1、2 d，处理组Scd基因表达量显著升高(P<0.05，图4c)。芳香化酶抑制剂处理后2 d，随剂量增加Stat3基因表达量显著升高(P<0.05，图4d)。芳香化酶抑制剂处理后3 d，处理组Bmp4基因表达量显著升高(P<0.05，图4e)。

图4 芳香化酶抑制剂处理后脂代谢基因表达

3 讨 论

3.1 雌激素缺乏对雄性中华鳖脂代谢的作用

雌激素在动物体内有广泛的生理功能，也是非哺乳动物性别分化的关键影响因素。雌激素及其编码基因(Cyp19a1基因)是水产动物育种研究中的关键基因，通过抑制雌激素功能发挥或降低Cyp19a1基因表达，均会导致遗传雌性个体性腺分化过程发生性逆转。因此，可以通过降低激素水平或编辑Cyp19a1基因培育全雄群体，但雌激素缺乏对雄性个体的影响研究尚少。笔者通过腹腔注射芳香化酶抑制剂和雌激素受体拮抗剂，研究雌激素缺乏后雄性中华鳖脂代谢的变化，为后续中华鳖全雄群体的培育和养殖提供参考。

3.2 雌激素受体拮抗剂处理后中华鳖肝脏组织脂滴形态变化

雌激素对动物脂代谢有重要的调控作用。在裸鼠中，高雌激素环境脂肪细胞体积显著减小，低雌激素环境脂肪细胞肥大[25]。雌激素受体拮抗剂处理后雄性体内也会产生脂肪堆积[26]。本试验中，雌激素受体拮抗剂处理后，中华鳖肝脏组织中形成明显的脂滴，脂肪含量增加，脂肪细胞体积增大，且高剂量组的脂滴含量明显高于低剂量组。这一结果表明，雌激素受体拮抗剂处理后中华鳖体内出现了脂肪积聚，且呈剂量效应。

3.3 雌激素受体拮抗剂处理后Cyp19a1基因和脂代谢相关基因表达模式

为研究雌激素受体拮抗剂处理对脂肪合成和分解代谢的影响，笔者通过实时荧光定量PCR分析相关基因表达。Fas、Pparγ、Scd和Stat3基因是脂代谢过程中脂肪沉积的相关基因，分别调控甘油三酯的合成、肌内脂肪的含量、单不饱和脂肪酸的合成及脂肪的合成，Bmp4基因参与脂肪的分解过程[27-31]。不同剂量雌激素受体拮抗剂处理1 d后，随剂量增加Cyp19a1基因表达量降低，可能是由于雄鳖体内雌激素合成减少所致，这与姚亚运等[23]在斑马鱼中的相关研究结果一致。处理4、42 d后，随剂量增加Cyp19a1基因表达量反而显著上升(P<0.05)，可能是药物处理导致雄鳖体内雌激素缺乏，动物机体出现的反馈机制。两种剂量的雌激素受体拮抗剂均引起Fas基因表达量的显著升高，促进体内甘油三酯合成，增加脂肪沉积。1、4 d处理组Fas基因表达量降低，可能是Cyp19a1基因表达降低所引起的反馈调节。1、4 d处理组基因Pparγ基因和Stat3基因在高剂量组中表达量显著升高，Scd基因和Bmp4基因在处理42 d后的低剂量组中表达量显著升高，高剂量表达量低于剂量组，表明不同剂量的芳香化酶抑制剂处理对脂肪调节代谢有显著性差异。42 d后处理组Fas基因表达量增加，肝组织脂肪沉积，这与肝脏组织油红O染色后观察结果一致。处理后42 d，脂肪分解相关的Bmp4基因表达量升高，脂肪沉积相关的Scd、Pparγ和Stat3基因表达量增加。这与Phrakonkham等[32]研究结果一致，雌激素干扰后，Fas基因和Pparγ基因的表达量均上调。本试验结果表明，雌激素受体拮抗剂处理后中华鳖肝脏脂肪分解和合成代谢增强，脂肪含量增加。

3.4 芳香化酶抑制剂处理后Cyp19a1基因和脂代谢相关基因表达模式

来曲唑芳香化酶抑制剂处理雄性中华鳖后，其芳香化酶活性降低，导致成熟精子数目减少[33]。本试验中，芳香化酶抑制剂处理后49 d，低剂量组Cyp19a1基因表达量升高，高剂量组Cyp19al基因表达量降低，表明雌激素的合成途径受到影响，且呈剂量效应。Fas、Scd和Pparγ基因在芳香化酶抑制剂处理1、2、3 d后表达量呈上升趋势，表明甘油三酯和单不饱和脂肪酸合成增加，肌内脂肪含量增加。Stat3基因在芳香化酶抑制剂处理2 d后随剂量增加表达量显著升高，Bmp4基因在处理2 d后表达量升高，3 d后表达量显著升高(P<0.05)。芳香化酶抑制剂处理后1、2、3 d脂代谢相关基因的高表达，说明芳香化酶抑制剂处理前期引起脂肪积累。芳香化酶抑制剂处理后49 d，Pparγ、Stat3和Bmp4基因表达量降低，表明芳香化酶抑制剂处理后期脂代谢积累调控途径受到抑制。Fas基因在低剂量组和Scd基因在高剂量组中的表达量升高，表明芳香化酶抑制剂的剂量干扰脂肪代谢情况，低剂量组和高剂量组均有脂肪积累。芳香化酶抑制剂和雌激素受体拮抗剂在脂代谢调控中的差异，说明雌激素介导的脂肪代谢调控网络与体内的雌激素浓度或受抑制程度显著相关，但具体的调控机制有待进一步研究。

4 结 论

使用抗雌激素药物会使雄性中华鳖脂代谢紊乱，导致肝脏内脂肪的积聚。雌激素受体拮抗剂处理后中华鳖肝脏脂肪分解和合成代谢增强，脂肪含量增加。芳香化酶抑制剂的剂量干扰脂肪代谢情况，低剂量组和高剂量组均有脂肪积累，说明这种代谢紊乱受抗雌激素药物浓度的影响。笔者探究了中华鳖脂肪代谢调控的途径过程，雌激素及其受体与脂肪代谢的相关调节过程，结果可为培育高质量“全雄鳖”提供理论依据。