环境DNA技术在邵伯湖鱼类资源监测中的应用

唐晟凯，刘燕山，王 华，李大命，张彤晴，孙晶莹，许 飞，王志浩

( 1.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017； 2.江苏省高宝邵伯湖渔业管理委员会办公室，江苏 扬州 225009； 3.南京易基诺环保科技有限公司，江苏 南京 211100 )

在水域生态系统中，生物有机体可以通过黏液、唾液、尿液、粪便、血液等多种途径向环境中释放DNA。环境DNA宏条形码技术(下称“环境DNA技术”)是通过从环境介质中提取DNA，对基因组的特定DNA片段进行PCR扩增和高通量测序，从而实现对生物群落的监测[1-3]。环境DNA技术最早于20世纪末应用于微生物学研究，主要用于研究微生物的分类及其生化功能[4-5]；自2003年DNA条形码被标准化以来，该技术逐步被应用于底栖动物、鱼类、两栖动物等不同水生生物的监测[6-12]；2015年以后，该技术开始被大量应用于我国的鱼类、长江江豚(Neophocaenaasiaeorientalis)、浮游动物等水生生物的监测[13-15]。

邵伯湖位于江苏省扬州市近郊，与高邮湖连通，属淮河水系，是淮河入长江的通道，水域面积约77 km2，具有渔业、蓄洪、灌溉等功能。根据20世纪50年代的调查，邵伯湖、高邮湖、宝应湖有鱼类共计70多种[16]。近20年来，其鱼类资源受到捕捞作业、江湖阻隔等人为因素的影响，资源状况可能发生了一定的变化。然而近年来，鲜有对邵伯湖鱼类资源的公开报道。传统的鱼类监测，主要依靠不同的渔具进行样本采集，过程费时费力，小型或稀有个体难以捕获，且对鱼类具有不同程度的伤害[13,17]。笔者利用邵伯湖水体的环境DNA样本进行鱼类资源监测，不仅可为邵伯湖鱼类资源保护以及长江大保护提供基础数据，而且有助于探索高效、对生态系统干扰小的淡水鱼类资源监测新方法。

1 材料与方法

1.1 采样点位设置

在邵伯湖全湖设置15个采样点，其中北部敞水区、中部敞水区和南部河道区分别设置4个、5个和6个采样点。采样点分布见图1(采样点简称S1～S15)。

图1 采样点分布Fig.1 Distribution of sampling sites in Shaobo Lake

1.2 采样及样品前处理

样品采集于2018年11月7日。在每个采样点上，用无菌聚丙烯瓶(赛默飞世尔，美国)采集2 L表层水(在水面以下约20 cm处采集)，现场用0.22 μm混合纤维素酯(MCE)滤膜(易基诺，南京)过滤，每张滤膜过滤300 mL水样，每个点位过滤滤膜5～6张作为平行样品，过滤后的滤膜用干冰存储。

1.3 DNA提取

使用DneasyPowerWater Kit(天根，德国)提取滤膜DNA，具体操作如下：将滤膜置于带有研磨珠的5 mL离心管内，加入1 mL的55 ℃ PW1，均质5 min，吸取全部上清液离心1 min；取上清液加入200 μL IRS，涡旋混匀后于4 ℃静置5 min，离心1 min；取上清液加入650 μL PW3，混匀后过MB Spin Column富集DNA；分别加650 μL PW4和650 μL乙醇清洗，用100 μL EB洗脱。使用NanoDrop 2000测定DNA浓度和纯度，并于-20 ℃冷冻存储。

1.4 PCR扩增

线粒体12S rRNA区域具有高保守性和高可变性，是脊椎动物鱼类检测中常用的引物区域，该引物提高了鱼类环境DNA扩增能力[18-19]。笔者利用线粒体DNA 12S rRNA引物[18]进行PCR扩增，12S rRNA引物PCR扩增体系：总体系50 μL，包含2×Phusion Master Mix with HF Buffer 25 μL(赛默飞世尔，美国)，上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。扩增条件：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，66 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，30个循环。同时，利用线粒体COⅠ引物[20]进行鱼类PCR扩增对比，反应体系与12S rRNA引物一致，反应条件：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，48 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，30个循环。2组体系均设置PCR阳性和阴性对照，以30种鱼类组织混合DNA为阳性对照，ddH2O为PCR阴性对照。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳进行目的条带检测。使用AMPure XP(贝克曼库尔特，美国)磁珠纯化PCR产物。

1.5 高通量测序及数据分析

使用NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent试剂盒(NEB，美国)构建二代测序文库后，Agilent 2100检测DNA文库质量，稀释DNA文库至100 pmol/L，利用Ion Proton测序仪进行样品的二代测序。二代测序数据下机后，数据分析全部基于Ubuntu 14.04版本下的EcoView软件。利用EcoView软件中USEARCH进行物种运算分类单元聚类，基于美国国家生物技术信息中心数据库完成物种注释。

2 结果与分析

2.1 12S rRNA引物与COⅠ引物PCR结果

将同一点位平行样品混合后分别进行12S rRNA引物和COⅠ引物扩增，PCR结果见图2，15个采样点样本的2对引物扩增产物中均有目的条带，且条带清晰单一，阴性对照无显著条带。12S rRNA引物扩增中S3、S4、S8、S9、S12和S14位点扩增效果最好，目的条带最亮；S1、S2、S6、S10、S13位点扩增效果较好，目的条带较亮；S5、S7、S11、S15位点扩增效果稍低，目的条带较暗。15个样本COⅠ引物扩增的效率基本一致，条带亮度一致。

图2 12S rRNA引物与COⅠ引物PCR结果Fig.2 The results of PCR using mitochondrial DNA 12S rRNA and COⅠ primers

2.2 12S rRNA引物与COⅠ引物检测结果

12S rRNA测序共获得0.95 Gb数据量，2 522 310条序列，过滤低质量、序列长度小于80 bp和大于250 bp等数据后，获得140 463条序列。由图3a可见：注释到辐鳍鱼纲的序列50 427条，占总序列数36%；注释到哺乳纲的序列74 147条，占53%；注释到鸟类的序列2407条，占2%；未注释出的序列13 482 条，占总序列数9%。按序列相似性97%进行物种聚类，共获得171个运算分类单元，其中：71个辐鳍鱼纲运算分类单元，占比41%；56个哺乳纲运算分类单元，占比33%；5个鸟类运算分类单元，占比3%；39个运算分类单元未注释出，占比23%。

图3 12S rRNA引物与COⅠ引物测序结果Fig.3 Sequencing results of mitochondrial DNA 12S rRNA and COⅠ primersa.12S rRNA引物测序序列数与运算分类单元数分布； b.COⅠ引物测序序列数与运算分类单元数分布.a.the distribution of reads and OTUs using 12S rRNA primers； b.the distribution of Reads and OTUs using COⅠprimers.

线粒体COⅠ测序数据过滤低质量、序列长度小于200 bp和大于600 bp等数据后，获得291 379条序列。由图3b可见：注释到后生动物的序列170 654条，占比最高，约占总序列数的59%，后生动物中注释到辐鳍鱼纲的序列仅有990条，其他注释到后生动物的序列总数为169 664条，主要是节肢动物、轮虫和其他脊椎动物等后生动物；共有29 302条序列注释到绿色植物，约占总序列数的10%；共有6682条序列注释到真菌，约占总序列数的2%；共有84 741条序列未注释到物种。线粒体COⅠ测序数据共注释出1135个运算分类单元：注释到后生动物的运算分类单元高达782个，占总运算分类单元数的69%，后生动物中注释到辐鳍鱼纲的仅有16个；注释到绿色植物的运算分类单元145个，占总运算分类单元数的13%；注释到真菌的运算分类单元72个，占总运算分类单元数的6%；其他未注释到物种的运算分类单元136个，占总运算分类单元数的12%。

2.3 12S rRNA引物与COⅠ引物检测结果对比

虽然12S rRNA引物检测结果获得的总序列数和总运算分类单元数小于COⅠ引物检测结果，但前者注释到鱼类的序列数和运算分类单元数明显高于后者(图4)。在12S rRNA引物注释出的171个运算分类单元中，鱼类运算分类单元占71个，分属40个物种；而在COⅠ引物注释出的1135个运算分类单元中，鱼类运算分类单元仅占16个，分属9个物种。结果表明，12S rRNA引物对鱼类物种的监测能力优于COⅠ引物。

图4 12S rRNA引物与COⅠ引物检测结果Fig.4 Detection results of mitochondrial DNA 12S rRNA and COⅠ primersa.2种引物序列数对比；b.2种引物注释运算分类单元数对比a.the number of reads using two primers； b.the number of OTUs and species using two primers.

2.4 12S rRNA引物鱼类检测分析

表1 环境DNA检出的鱼类种类

图5 鱼类群落组成分析Fig.5 Analysis of fish community compositiona.鱼类群落组成；b.注释的40种鱼类序列数；c.15个采样位点鱼类组成分布.a.fish community composition； b.number of sequences of 40 fish species annotated； c.fish composition distribution in 15 sampling sites.

表2 鱼类物种在各采样位点的分布

3 讨 论

3.1 邵伯湖鱼类物种检测

近年来，越来越多的学者利用环境DNA技术调查湖泊、河流的生物组成[21-24]，笔者利用环境DNA技术调查邵伯湖15个位点的鱼类物种多样性，初步分析邵伯湖鱼类资源现状。利用环境DNA共监测到40种鱼类运算分类单元，其中有36种注释到种，4种注释到属。在20世纪50年代的调查中，邵伯湖、高邮湖、宝应湖共计有鱼类70多种[16]。由于缺少所有70多种的鱼类物种名称，因此本次监测的结果难以与之进行全面的对比。与当时调查到的主要经济鱼类对比，本次未监测到的经济鱼类有鳊(Parabramispekinensis)、黄鳝(Monopterusalbus)、鳗鲡(Anguillajaponica)3种。由于邵伯湖深度较浅，本次监测的监测点水深为1.6～2.2 m，环境DNA比较均质，不需要分层取样。本次监测到的鱼类中，河川沙塘鳢、小黄黝鱼、粘皮鲻虾虎鱼、波氏吻虾虎鱼等为典型的底层鱼类[25]。以上3种未监测出的鱼类中，只有黄鳝为底层鱼类。未监测到的原因可能是多方面的，如：由于江湖阻隔、过度捕捞等人为因素，洄游性鱼类的资源量大大减少等；目前鱼类环境DNA监测方法不尽完善[26-27]，且扩增引物具有偏好性[28]，当样本中某些鱼类DNA含量较低时，也较难检出。

3.2 各物种检测到的序列总数

3.3 12S rRNA引物和COⅠ引物对鱼类监测效果的对比

鱼类环境DNA监测中，常用线粒体12S rRNA、COⅠ，CYTB和18S r RNA等区域引物进行扩增，检测效果尚无一致性结论。笔者用线粒体12S rRNA和COⅠ引物同时进行扩增，进而对比2种引物对鱼类的监测效果。结果显示，12S rRNA引物检出的鱼类物种数是COⅠ引物的4.4倍，鱼类检出效果明显优于COⅠ引物。原因可能在于，12S rRNA引物针对脊椎动物设计，在脊椎动物中更加保守，容易扩增。COⅠ引物主要针对动物类群设计[32]，而环境DNA中鱼类DNA含量极少，且后生动物DNA含量极高，该引物会优先偏好性地扩增浮游动物[33-34]、大型底栖无脊椎动物[35]等后生动物。因此，12S rRNA引物更适合应用于淡水鱼类的环境DNA监测。

3.4 环境DNA技术在湖泊鱼类资源监测中的应用前景

环境DNA技术为淡水鱼类资源监测、物种多样性评价等提供了新的方法，具有广阔的应用前景。相比传统的监测方法，运用环境DNA技术具有以下主要优势：采样过程简单，需要的人力与时间成本较低，且对生境无破坏，无需接触鱼体，可应用于难以进行传统捕捞监测的水域(如已实施全面禁捕的水域、生态系统比较脆弱的水域等)；不依赖物种鉴定专家，减少了物种鉴定中的主观差异；灵敏度高，对不易捕获或稀有种类的监测效果较好。运用环境DNA技术进行鱼类资源监测仍存在一些局限，如缺乏技术规范、少数近缘物种因序列相似而难以区分以及无法反映鱼类的生理状态、生长发育阶段等生物学特征等。

因此，在现阶段的淡水鱼类资源监测中，环境DNA技术宜与传统的监测方法结合使用，同时仍需对该技术进行不断的发展与完善。

4 结 论