菲律宾蛤仔血细胞透射电镜样品制备固定液的筛选

刘 静，袁玉清

( 1.青岛农业大学 中心实验室，山东 青岛 266109； 2．温州医科大学 环境与公共卫生学院，浙江 温州 325035 )

菲律宾蛤仔血细胞透射电镜样品制备固定液的筛选

刘 静1,2，袁玉清1

( 1.青岛农业大学 中心实验室，山东 青岛 266109； 2．温州医科大学 环境与公共卫生学院，浙江 温州 325035 )

对样品的固定是透射电镜样品制备的关键环节，通过在透射电镜下观察和比较不同固定液固定菲律宾蛤仔血细胞后血细胞超微结构的变化，初步筛选出适合菲律宾蛤仔血细胞透射电镜制样的固定液。试验结果表明，固定液可直接影响到透射电镜制样品质的高低，2.5%、5%戊二醛低渗固定液引起了血细胞细胞器的肿胀，其中线粒体肿胀尤为严重，肿胀程度2.5%戊二醛组大于5%戊二醛组；等渗固定液固定的血细胞细胞器不肿胀，但等渗5%戊二醛与4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液对血细胞的精细结构保存不佳，而2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液对血细胞超微结构保存较好，表现为细胞外膜结构清晰，细胞质基质丰富且分布均匀，细胞内线粒体、内质网、高尔基体、细胞核等细胞器固定效果较好。试验得出，低渗固定液会导致细胞肿胀，线粒体对渗透压的要求较其他细胞器更加敏感；提高固定液含量会减轻因低渗引起的细胞肿胀程度，但高含量固定液会损坏细胞内精细结构，故适合的样品固定液是细胞精细结构较好保存的基础。

菲律宾蛤仔；血细胞；透射电镜；制样固定液

菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)是我国南北沿海广泛分布，且较为重要的海水经济贝类，其免疫系统属非特异性免疫，主要有血细胞免疫和体液免疫两部分组成，其中血细胞通过吞噬、凝集和包囊等作用清除异物和自身损伤、死亡的细胞，还能够通过产生各种非特异性体液因子来参与宿主的免疫防御系统，在贝类的免疫防御过程中起着重要的作用[1-2]。目前关于菲律宾蛤仔血细胞形态、免疫功能的研究还较少[3-7]。利用透射电镜可以揭示生物细胞中各种细胞器的超微结构，而且可以对生物大分子，特别是核酸、蛋白质、酶、抗原等在超微结构中准确定位、定性，但是目前国内外尚无菲律宾蛤仔血细胞透射电镜样品制备的研究。

超薄切片技术是最常用的透射电镜样品制备技术，样品制备过程包括取材、样品固定、脱水、渗透、包埋、超薄切片、染色等环节，其中样品固定的好坏可直接影响到透射电镜制样的成败和品质的高低，甚至会造成试验假象，影响试验结果，因此对样品固定液的选择是获得理想透射电镜观察结果的关键条件之一。本文选取5种不同样品固定液对菲律宾蛤仔血细胞进行固定，将制好的血细胞超薄切片在透射电镜下进行超微结构的观察和比较，从而筛选出适合菲律宾蛤仔血细胞透射电镜制样的固定液，为今后利用透射电镜研究菲律宾蛤仔及其他海产双壳贝类的血细胞分类、免疫学功能、病理学等方面提供可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菲律宾蛤仔购自青岛城阳水产品批发市场，壳长(3.52±1.97) cm，体质量(8.23±0.197) g。试验用蛤仔暂养于塑料水箱中，水温约16 ℃，每日早晚各换新鲜海水1次，暂养3 d后进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1 不同固定液配方

中贝类血细胞透射电镜制样固定液，并有所改进，从制样固定液的组成、含量和渗透压方面考虑，选取了5种制样固定液，其配方见表1。

表1 5种不同贝类血细胞透射电镜制样用的固定液配方

1.2.2 血淋巴的抽取与制备

选取健康有活力的菲律宾蛤仔，无菌海水冲洗后，用1 mL的无菌注射器预先吸入一定量预冷固定液, 再从菲律宾蛤仔闭壳肌处1∶1抽取血淋巴，每个试验组抽取3枚菲律宾蛤仔的血淋巴，迅速混匀，冰上保存。抽取的血淋巴4 ℃，3000 r/min 离心10 min，去掉上清液，血细胞沉淀立即加入4 ℃新鲜固定液固定。每种固定液重复制样3次。

1.2.3 透射电镜样品制备

血细胞在各自固定液中4 ℃固定过夜，3000 r/min离心10 min，血细胞沉淀用2.5%的琼脂预包埋后，0.1 mol/L二甲胂酸钠缓冲液清洗血细胞，再用1%锇酸后固定血细胞2 h，0.1 mol/L二甲胂酸钠缓冲液清洗血细胞后，进行丙酮梯度脱水，Spi-pon812环氧树脂树脂浸透包埋以及聚合，Leica UC7超薄切片机切片，切片厚度70 nm，超薄切片经醋酸铀和柠檬酸铅染液双染色，日立HT7700型透射电镜观察并拍照，加速电压80 kV。

1.2.4 试验结果的评价方法和标准

透射电镜下观察和比较不同制样固定液固定菲律宾蛤仔血细胞后其超微结构的变化时，主要观察细胞的细胞质膜、细胞质基质、粗面内质网、线粒体、细胞核等细胞器超微结构保存是否良好。其固定良好的细胞超微结构的形态特征参照表2。

表2 固定良好的细胞超微结构的形态特征

2 结 果

2.1 低渗2.5%戊二醛固定液对菲律宾蛤仔血细胞超微结构的影响

经2.5%戊二醛固定液处理的细胞整体完整，但细胞质基质分布不均匀，部分区域呈现空白(图1a)；线粒体肿胀，基质浅，线粒体嵴变少；肿胀严重的线粒体基质颗粒消失，基质中出现多个亮区，线粒体嵴亦消失，部分线粒体外膜出现破裂(图1b)；大部分高尔基体保存完好，少数高尔基体囊膜膨胀模糊不清(图1c)；粗面内质网核糖体颗粒散落，显示不清，部分内质网膜不完整(图1d)，细胞内部分颗粒肿胀，膜破裂(图1e)；细胞核异染色质保存较好，部分常染色质部位出现空白区域(图1d)；细胞核核周隙宽度不均匀，外膜呈波浪状，局部肿胀呈山丘状(图1f)。

图1 2.5%戊二醛固定液对菲律宾蛤仔血细胞超微结构的影响N：细胞核；Mi：线粒体；G：高尔基体；RE：粗面内质网；GR：颗粒.

2.2 低渗与等渗5%戊二醛固定液对菲律宾蛤仔血细胞超微结构的影响

两种固定液固定的血细胞细胞质、线粒体基质和核基质丰富。低渗5%戊二醛固定液组中细胞大部分线粒体嵴显示不清，部分线粒体肿胀、外膜发生破裂(图2a)，粗面内质网上核糖体部分散落，部分核膜膨胀(图2b)，肿胀程度低于2.5%戊二醛固定液；等渗5%戊二醛固定液固定后细胞无肿胀现象，但细胞内膜系统的膜性精细结构保存不佳，表现为大部分高尔基体膜、核膜显示不清(图2c)，线粒体外膜、线粒体嵴、粗面内质网膜不清晰，但粗面内质网上负载的核糖体丰富，清晰可见(图2d)。

图2 低渗与等渗5%戊二醛固定液对血细胞超微结构的影响N：细胞核；Mi：线粒体；RE：粗面内质网；★：细胞核膨胀部位.

2.3 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液对菲律宾蛤仔血细胞超微结构的影响

2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液固定血细胞后，细胞基质均匀丰富，各细胞器精细结构保存较好，无肿胀现象(图3a)。细胞质膜三层结构显示清晰，线粒体基质丰富，线粒体嵴清晰可见(图3b)；粗面内质网保存较完整，负载的核糖体清晰(图3c)；高尔基体保存较好(图3d)；细胞中花瓣状的颗粒外膜和基质紧密贴合(图3e)；核膜清晰，核基质丰富(图3f)。

图3 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液对菲律宾蛤仔血细胞超微结构的影响N：细胞核；Mi：线粒体；RE：粗面内质网；G：高尔基体；GR：颗粒.

2.4 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液对菲律宾蛤仔血细胞超微结构的影响

4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液固定的血细胞细胞质基质不均匀，胞质中部分基质明显变浅，但线粒体基质和核基质保存较好(图4a)。细胞外膜及胞质内膜精细结构保存不佳，表现为大部分线粒体外膜和线粒体嵴显示不清(图4b)，高尔基体大部分保存不完整，核膜双层膜结构显示不清(图4c)，粗面内质网膜显示不清晰，但内质网上核糖体显示清晰(图4d)。

图4 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液对菲律宾蛤仔血细胞超微结构的影响N：细胞核；Mi：线粒体；G：高尔基体；RE：粗面内质网.

3 讨 论

利用透射电镜可观察细胞的超微结构，探明细胞的功能以及生理调节机制，随着透射电镜分辨率的不断提高，其清晰度已不完全取决于显微镜的分辨率，而是很大程度上取决于样品制备的好坏。在贝类血细胞的超微结构研究中，多数学者应用了超薄切片技术，但制样细节不尽相同，主要表现为固定方式、样品固定液种类、固定时间、固定温度、缓冲液种类及包埋树脂等方面存在差异[10-11,13-20]。本试验在其他条件一致的前提下，主要研究了固定液种类对菲律宾蛤仔血细胞超微结构的影响。

透射电镜制样过程中，对样品固定的目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，并且牢固地固定在其原来所在的位置上，避免在以后的清洗和脱水时溶解和流失，使结构更加清晰。样品固定是一种复杂的化学过程，固定液的组成、含量、渗透压、pH等都会对样品的固定效果产生影响。

在超薄切片制样中，固定方式一般采用双固定，即醛类固定液前固定，锇酸后固定，醛类固定液一般选用戊二醛和多聚甲醛，两者混合使用效果更佳[21]。本试验结果表明，2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液效果最佳，证实了这一观点，但同时本文研究结果亦发现两者混合使用时，必须要求多聚甲醛和戊二醛的含量配比合适才能得到较好的固定效果。相同的固定时间，较低含量的固定液对样品固定可能不彻底，而较高含量的固定液容易毁坏酶的活性和细胞的精细结构[21]，比较本试验中2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液与4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液的组成，除了多聚甲醛含量不同，其余条件均一致，但是2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液的效果远好于4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液，笔者认为可能由于4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液中多聚甲醛含量高引起的；试验结果亦显示5%戊二醛含量的固定液试验组血细胞的精细结构保存亦不佳。由此笔者推测4%多聚甲醛-2.5%戊二醛、5%戊二醛固定液对于菲律宾蛤仔血细胞而言固定剂的含量太高，破坏了血细胞的精细结构。

一般来说，低渗固定液容易引起组织肿胀，而高渗固定液容易造成组织收缩，但也有学者提出调解渗透压平衡是不必要的，因为渗透压平衡只存在于活细胞中，细胞一旦和固定液接触，即被固定并死亡，因此失去了渗透压平衡调节的能力[21]。在已发表的贝类血细胞透射电镜制样的文献中，有学者在固定液和缓冲液中通过添加蔗糖[10]、氯化钠[11]或者海水[17-18]来调节固定液的渗透压平衡，而有学者则没考虑固定液渗透压[9]。菲律宾蛤仔属于海水贝类，其体内渗透压要比淡水生物的渗透压要高，本文选取的低渗2.5%、5%戊二醛固定液没有考虑到固定液渗透压，细胞器发生肿胀，尤其是线粒体肿胀明显，提高戊二醛的含量，线粒体的肿胀程度会降低，而等渗固定液通过添加蔗糖或NaCl调节了固定液的渗透压，细胞没有发生肿胀。这充分说明了在选择菲律宾蛤仔血细胞固定液时一定要考虑固定液和缓冲体系的渗透压，调节固定液的渗透压和固定样品渗透压一致，同时试验表明细胞内线粒体相比其他细胞器对固定液渗透压变化敏感。

通过本研究，笔者发现，固定液渗透压、含量对菲律宾蛤仔血细胞超微结构影响较大，低渗固定液使细胞内的细胞器肿胀，尤其是线粒体较其他细胞器更加敏感，提高固定液的含量能部分缓解细胞器的肿胀，但是高含量的固定液对细胞内精细结构保存不佳。所以合适的固定液含量以及离子组成是细胞超微结构较好保存的关键。

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ScreeningofSpecimenPreparationandFixativesofManilaClamRuditapesphilippinarumHaemocytesforTransmissionElectronMicroscopy

LIU Jing1,2, YUAN Yuqing1

( 1.Central Laboratory, Qingdao Agriculture University, Qingdao 266109,China；2.School of Environmental Science and Public Health，Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035，China )

Fixation is the key step of the specimen preparation for transmission electron microscopy. The aim of this paper is to investigate and compare the influence of 5 different fixatives on the ultrastructure alterations of haemocytes in Manila clamRuditapesphilippinarumusing transmission electron microscope in order to find the proper fixative for Manila clam. The results showed that fixative affected the haemocyte ultrastructure directly. The haemocytes were swelled in 2.5% and 5% glutaraldehyde groups, the higher in 2.5% glutaraldehyde groups than in 5% glutaraldehyde fixative treatments, and higher swollen in the haemocytes mitochondria than in the other organelles. No organelles swelling was found in isotonic fixative treatments, while the inner structures of the haemocytes were not preserved very well in 5% glutaraldehyde fixative with 7% saccharose groups and 4% paraformaldehyde-2.5% glutaraldehyde fixative treatments, especially the endomembrane system. In 2% paraformaldehyde-2.5% glutaraldehyde fixative treatments, the haemocytes had better ultrastructure than in other groups, with clear outer membrane structure of haemocytes. The cytoplasmic matrix was rich and evenly distributed, as well the ultrastructure of the organelles such as mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus and the nucleus were better preserved. From this study we can concluded that the hypotonic fixative could cause haemocytes swelling and that the mitochondria are more sensitive to the fixative osmotic pressure than other organelles. Raised fixative concentration reduces the cell swelling degree, but the high fixative concentration is not benefit to the haemocytes ultrastructure. Thus the suitable fixative is the foundation of the cell ultrastructure preservation.

Ruditapesphilippinarum; haemocyte; transmission electron microscope; sample fixative

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.05.013

S917.4

A

1003-1111(2016)05-0535-06

2016-03-01；

2016-05-06.

国家自然科学基金资助项目(31302166)；浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室开放基金资助项目(J2013004).

刘静(1982—)，女，助理研究员，博士研究生；研究方向：贝类免疫学. E-mail：liujingandlele@163.com.