不同杀菌剂对小麦真菌毒素污染防控及农药残留风险评估分析

吴 丽，孙 娟,2，张慧杰，胡学旭，李为喜，孙丽娟，张 妍，杜文明，王步军

(1.中国农业科学院作物科学研究所/农业农村部谷物产品质量安全风险评估实验室(北京)，北京 100081; 2.北京市水产技术推广站/农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心(北京)，北京 100170)

小麦赤霉病(Fusarium head blight，简称FHB或Scab)是由镰孢菌属(Fusariumspecies)病菌引起的一种典型的气候型、世界性病害，以温暖潮湿和半潮湿地区较重，是危害小麦生产的主要病害之一。赤霉病菌侵染小麦后，不仅会严重影响其产量与品质，其产生的多种真菌毒素进入食物链还可严重危害牲畜与人类健康。我国小麦赤霉病主要发生于湿润多雨的长江流域和沿海麦区。小麦在不同生育期都可能感染赤霉病，抽穗扬花期是最易感病期，若此时遇阴雨天气，极易造成赤霉病大流行,可造成小麦减产10%～20%，严重时减产达80%～90%[1]。赤霉菌产生的常见真菌毒素包括单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、伏马毒素(fumonisins，FB)等[2]；脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是在小麦中污染水平最高的一种倍半萜类化合物，可在食物链中长期存留，对人类和牲畜的健康造成极大威胁[3-4]。因而赤霉病成为制约我国乃至世界小麦安全生产的重要因素之一。目前，生产上具有赤霉病抗性的小麦品种较少，施用化学杀菌剂仍是防控小麦赤霉病最有效和最常用的方法。我国用于防治小麦赤霉病的药剂主要有多菌灵、氰烯菌酯、咪鲜胺和甲基托布津、三唑醇、嘧菌酯等杀菌剂及其复合剂[5-7]。合理使用杀菌剂可有效抑制小麦赤霉病的发生，对发病较为严重的地区需要多次喷药以控制赤霉病，抑制其产生的真菌毒素污染粮食。但杀菌剂过量使用会造成其在小麦中残留量过大，即防治毒素污染的同时会带来农药残留的潜在威胁，两者均为小麦安全生产中的关键危害因子。本研究拟通过喷施不同类型杀菌剂及施药次数探索其对小麦籽粒中真菌毒素污染的防控效果及其残留风险，旨在寻求小麦赤霉病化学防控的平衡点，达到既能有效防治小麦赤霉病毒素污染又能尽可能减少农药残留的目的，为我国小麦安全生产及食品安全提供决策依据。

1 材料与方法

1.1 田间试验

1.1.1 试验药剂

供试药剂：50%多菌灵WP(可湿性粉剂)生产于江苏蓝丰生物化工股份有限公司；25%氰烯菌酯SC(悬浮剂)生产于江苏省农药研究所股份有限公司；25%咪鲜胺EC(乳油)，江西正邦作物保护有限公司；70%甲基托布津WP，生产于上海悦联化工有限公司。

1.1.2 试验设计

试验田分别位于小麦赤霉病发生较为严重的河南省信阳市和湖北省襄阳市两地，试验点土壤肥力中等且基本一致。供试小麦品种为扬麦16和扬麦20(中感赤霉病品种)，采取直播方式，于2016、2017年连续两年开展试验。

使用电动喷雾器喷施杀菌剂，第一次喷药时间为小麦抽穗后扬花率达10%时，隔5 d喷第二次，第三和第四次每隔7 d喷药一次。每种药剂分别喷施1～4次。随机区组设计，每个处理设三个重复，并设立保护隔离行。以等量清水喷雾作为对照(CK)，兑水量为15～20 L·hm-2,50%多菌灵WP、25%氰烯菌酯SC、25%咪鲜胺EC及70%甲基托布津WP 4种药剂的用药量分别为 1.5 kg·hm-2、2.25 L·hm-2、0.9 L·hm-2及 1.5 kg·hm-2。

1.1.3 调查内容与方法

每年六月初待小麦成熟后，各小区分别采取五点对角线方式取样(各点取样面积为10 m2)，脱粒，经晾晒混匀后低温保存，测定小麦籽粒DON与杀菌剂残留量。

1.2 测定方法

1.2.1 小麦中杀菌剂残留量检测

称取5.00 g样品于50 mL离心管中,加10 mL纯净水，30 min后加入10 mL乙腈(色谱级，美国Fisher公司)，振荡30 min；加入QuEChERS提取盐包(Part No:5982-0650,美国安捷伦)，用力振摇2 min，8 000 r·min-1离心5 min；转移8 mL上清液于QuEChERS净化管，振摇2 min，8 000 r·min-1离心5 min；取2 mL净化液于50 ℃水浴中氮吹至近干,以甲醇-水(1∶1,v∶v)溶解,混匀并定容至1 mL；过0.22 μm MICRO PES聚醚砜膜，滤液待测。

仪器条件：超高效液相色谱-串联四级杆质谱(UPLC-XEVO TQ,美国Waters公司),配有电喷雾离子源，液相色谱的色谱柱为ACQUITY BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm,粒径1.7 μm)， 流速为300 μL· min-1，柱温为26 ℃,进样体积为5 μL。流动相A为甲醇,流动相B为0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序为0～5.5 min,20%～85% A; 5.5～5.8 min,85%～100% A; 5.8～6.0 min,100%～20% A; 6.0 min,20% A,平衡2 min。

质谱分析中，应用电喷雾离子源(ESI+)、多反应监测(MRM)模式，毛细管电压2.50 kV，离子源温度110 ℃，去溶剂气流量1 000 L·h-1，去溶剂气温度500 ℃。其他质谱采集参数见表1。

1.2.2 小麦中DON含量检测

参照课题组已建立方法对DON进行测定[8]。DON标准品购买于美国Sigma公司，用甲醇配制成适当浓度的母液后置于-20 ℃保存。称取2.00 g样品于50 mL离心管中,加入80%乙腈-水溶液50 mL,180 r·min-1均质3 min后，8 000 r·min-1离心5 min；上清液用MycoSep 226多功能净化柱(Romer，美国)净化； 取4 mL净化液于50 ℃水浴中氮吹至近干；以甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵(1∶1,v∶v)溶解,混匀并定容至1 mL；过0.22 μm MICROPES聚醚砜膜(德国Membrana公司),待测。

仪器条件：液相色谱的色谱柱为CORTECS C18(100×2.1 mm,1.6 μm),流速为200 μL· min-1,柱温为40 ℃,进样体积为2 μL。流动相A为甲醇,流动相B为0.5%甲酸水溶液。梯度洗脱程序为0～3.5 min,5%～85% A; 3.5～4.5 min,85%～100% A; 4.5～5.0 min,100%～5% A; 5.0 min,5% A,平衡2 min。

质谱分析中，应用电喷雾离子源(ESI+); 多反应监测(MRM)模式采集; 毛细管电压2.50 kV; 离子源温度110 ℃,去溶剂气流量800 L·h-1; 去溶剂气温度450 ℃。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌剂对真菌毒素DON的防控效果

由图1可知，在对照处理下，信阳地区小麦中DON含量高达3 150 μg·kg-1，显著高于襄阳地区的污染水平(2 150 μg·kg-1)，表明两地区赤霉病的流行程度不同，但DON污染水平均超过国家限量值(500 μg·kg-1)。多次喷施四种杀菌剂均能显著降低小麦籽粒中DON累积量(P< 0.05)。其中多菌灵对DON的防控具有两面性，喷施50%多菌灵可湿性粉剂1次，小麦籽粒中DON的含量较对照增加18%(信阳)、7%(襄阳)；喷施2～4次，籽粒中DON含量显著降低，喷施2次为对照的55.3%(信阳)、64.5%(襄阳)；用药3次，为对照的24.0%(信阳)、29.2%(襄阳)；喷施4次，小麦籽粒中DON含量均较施药3次降低，其中信阳地区差别不大，而襄阳地区具有显著差异。

表1 农药和真菌毒素 UPLC-MS/MS测定参数Table 1 UPLC-MS/MS acquisition parameters for determination of pesticides and mycotoxins

25%咪鲜胺喷施1次后两地小麦中DON均有降低，其中信阳地区小麦中DON含量未呈现显著性降低，而襄阳地区小麦DON含量降低显著(P<0.05)；用药3次后籽粒中DON含量较对照均显著降低，较对照降低了55.1%～64.0%，继续增加施药次数，DON含量保持稳定。25%氰烯菌酯悬浮剂喷施1～4次，小麦籽粒中DON含量降至对照的42%～58%、29%～49%、 12%～21%及6%～10%，各处理间差异均显著，对DON的防控效果可达90%～94%。70%甲基托布津WP对籽粒中DON含量的影响与25%氰烯菌酯SC一致，施药1次籽粒中DON含量较对照显著降低，降至对照的37%～72%(信阳地区小麦中DON污染较为严重)，施药4次DON降至对照6%～12%。喷施以上4种杀菌剂3次后，信阳地区除25%咪鲜胺外，其他3种药剂均能使小麦籽粒中DON的污染水平降至安全限量值 以下。

2.2 喷药次数对小麦籽粒中杀菌剂残留量的影响

根据GB 2763-2019《食品安全标准 食品中农药最大残留限量》，小麦中多菌灵、咪鲜胺及甲基托布津的安全限量值均为500 μg·kg-1，氰烯菌酯的临时限量值为50 μg·kg-1。由图2可知，随着施药次数的增加，小麦中4种杀菌剂残留量均不断升高，其中以多菌灵残留量最大。多菌灵用药4次后，信阳、襄阳两地小麦籽粒中的残留量分别为502.54 μg·kg-1、547.38 μg·kg-1，均超过限量值。

甲基托布津、咪鲜胺与氰烯菌酯在两地区使用后的小麦籽粒中残留量均较小，喷施4次后，甲基托布津的残留量约60 μg·kg-1，氰烯菌酯的残留量约30 μg·kg-1，而咪鲜胺残留水平低于5 μg·kg-1。表明这三种杀菌剂的残留量对小麦安全生产影响较小。

2.3 DON含量与杀菌剂残留量的相关性分析

由表2可知，信阳地区小麦籽粒中4种杀菌剂的残留量与DON含量均呈显著负相关(P< 0.05)，以咪鲜胺残留量与毒素DON含量负相关性最强。襄阳地区小麦籽粒中除氰烯菌酯外的3种杀菌剂残留量与DON含量相关性不显著。对两地区小麦籽粒中杀菌剂残留量与所喷施农药次数进行相关性，结果(表3)发现，信阳地区4种农药的施药次数与其残留量均呈现显著正相关 (P<0.05)，相关系数为0.932～0.947；襄阳地区咪鲜胺的施药次数与其残留量呈现显著正相关 (P<0.05)，氰烯菌酯、甲基托布津残留量与喷施农药次数呈现极显著正相关(P<0.01)，相关系数为0.963与 0.913。

表2 小麦籽粒中杀菌剂药残留量与DON含量相关性分析Table 2 Correlation analysis of pesticide residues and DON levels of wheat grain

表3 小麦籽粒中杀菌剂残留量与施药次数相关性分析Table 3 Correlation analysis of spray time of 4 kinds of bactericides and pesticide residue amount

3 讨 论

本研究中，未采取防控措施时，信阳、襄阳两地小麦籽粒中DON的污染程度均超过国家限量值，说明在这两个地区小麦扬花至成熟期，如不采取恰当的防控措施会严重影响小麦安全生产。两地区小麦中DON污染水平有较大差异，信阳地区的污染程度较为严重，可能与流行菌的种类及当地气候环境(如在扬花灌浆期的降水量)、作物轮作方式、前茬作物秸秆处理方式以及小麦品种等有关[9]。前人研究发现，扬花期雨水较多会加重小麦赤霉病的发生，此外，玉米-小麦轮作也会加重赤霉病的发生[10-11]。四种杀菌剂能够不同程度降低小麦中DON的污染，其中，施用25%多菌灵对DON的防控效果表现出两面性，在两地施用1次后小麦籽粒中DON 的污染量均高于对照，这可能由于感病菌对多菌灵有一定抗药性，DON作为其次生代谢产物，在其生长过程中受到胁迫刺激而分泌出更高水平的DON毒素。已有大量研究表明，多菌灵对小麦赤霉病的防控效果逐年下降，镰刀菌会对其产生一定程度的抗药性[12-14]，如吴佳文等[13]研究发现，2018年江苏省部分县(市、区)分离自小麦穗部的赤霉病菌抗药菌株频率为53.18%，其中淮安市宝应湖农场抗药频率高达90.00%，徐州市丰县频率最低，为27.50%，县域差异达3.27倍；陈宏州等[14]研究结果表明，江苏省小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性频率高达50.58%。成晓松等[15]的研究表明，咪鲜胺、氯啶·戊唑醇、戊唑·咪鲜胺、氰烯菌酯·戊唑醇4种药剂对小麦赤霉病有良好的防控效果，防效均在 80%以上，可作为替代多菌灵防治小麦赤霉病，并指出最佳用药时间为扬花初期，最佳防治间隔为5～7 d。本研究中，喷施2次后，多菌灵与咪鲜胺处理的小麦籽粒中DON含量较氰烯菌酯与甲基托布津处理小麦中DON含量高，以氰烯菌酯的防控效果最佳，施药3次对小麦中DON的防控效果可达78.7%～87.1%。姚克兵等[16]的研究表明，在江淮赤霉病重发区，采用25%的氰烯菌酯悬浮剂在小麦扬花10%及扬花100%各施药1次(共2次)与抽穗后扬花前、扬花10%及扬花100%各施药1次(共3次)的处理均能有效防控小麦赤霉病，防控效果达到80%以上。因而在小麦生产中，尤其是江苏、安徽等小麦赤霉病发病严重地区，当赤霉病菌对多菌灵抗药性频率较高时，建议用新型高效杀菌剂以有效防控小麦赤霉病。

喷施杀菌剂可有效防控小麦赤霉病等病害的发生、降低真菌毒素的污染，然而杀菌剂又会带来小麦中杀菌剂残留的安全隐患。本研究发现，4种杀菌剂于小麦扬花期喷施2次的小麦籽粒中多菌灵残留含量最高，且超过国家粮食安全限量值，其他3种杀菌剂残留均没超过国家粮食安全限量值。刁春友等[17]在小麦抽穗扬花期使用多菌灵、氰烯菌酯等11种当前生产上推广应用的药剂，施药2次的小麦籽粒中仅发现多菌灵、氟环唑、甲基硫菌灵3种农药，其余农药基本检测不到。这与本研究结论一致。氰稀菌酯(JS399-19)作为一种新型合成化合物,对镰孢菌具有较高的专化活性，杀菌活性高，不仅可以有效降低小麦籽粒中DON毒素含量，且在籽粒中残留较少[18]。表明氰烯菌酯对小麦赤霉病的防控效果最佳。

研究发现，两地区4种杀菌剂喷施次数与其在小麦籽粒中的残留量呈现正相关关系，而杀菌剂残留量与DON的污染程度呈现不同程度的负相关性。信阳地区4种杀菌剂在籽粒中的残留量与DON含量均呈现显著负相关关系(P<0.05)，襄阳地区小麦籽粒中有3种杀菌剂残留量与DON含量相关性不显著。出现这种情况的原因可能与不同地区的温度、湿度及栽培耕作制度及发病菌种等相关[19-21]：(1)小麦生长环境条件，如温度、湿度及轮作方式，或者后期采收储运过程，均会影响毒素的累积水平，从而导致不同地区小麦中毒素的含量差异较大，与农残含量的相关性不太一致；(2)毒素的累积水平与真菌的产毒能力有关，不同地区流行的赤霉病菌种可能不同，因而即使小麦赤霉病发病程度相似，但毒素的累积水平仍能表现出较大差异。整体而言，杀菌剂的使用次数即杀菌剂使用量与DON的防控效果呈现正相关关系，但是过多使用杀菌剂尤其是多菌灵又会造成其残留超标问题，因而如何正确把小麦真菌毒素污染防控与杀菌剂残留风险控制在一个安全有效的平衡点在小麦安全生产中至关重要。本研究中，4种杀菌剂施药2～3次后对DON的防控可达到安全范围内，继续增加施药次数对DON防控效果没有显著增加。在实际生产中，要根据小麦赤霉病的发病程度合理施用杀菌剂，在保证对赤霉病有效防控的基础上尽量减少用量以保证小麦的安全生产。

4 结 论

50%多菌灵WP、25%氰烯菌酯SC、25%咪鲜胺EC、70%甲基托布津WP 4种不同类型的杀菌剂对小麦赤霉病均有一定的防治效果，随着施药次数的增加， 小麦籽粒中DON含量呈下降趋势。在4种杀菌剂中，氰烯菌酯对DON的防控效果最佳且残留水平较低；多菌灵对DON的防控效果较低且残留量最大。